小鼠近端肾小管上皮细胞分离

一、视频摘要
肾脏疾病是一种普遍的疾病,其种类繁多, 且患病率逐年升高, 是一类严重危害人类健康的疾病[1]。近端肾小管上皮细胞作为构成近端小管的重要细胞组分之一，与水、葡萄糖、氨基酸及药物的代谢密切相关，是研究急性肾损伤、慢性肾病、糖尿病肾病、肾间质纤维化等肾脏疾病的重要载体和工具细胞。目前许多研究的体外实验主要使用肾小管细胞株，但细胞株存在部分基因变异或缺失的情况, 与机体正常细胞的性状差异较大, 相较而言, 原代肾小管上皮细胞更能够反映细胞的生理状态[2]。使用小鼠模型，通过体外实验从这些肾脏中分离近端肾小管上皮细胞对进一步研究肾脏疾病的致病机制有重要意义。

二、关键词（3-5 个关键词便于被搜索）

小鼠近端肾小管上皮细胞、原代细胞、细胞分离与培养

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

2. 试剂和耗材

手术用具，75%酒精500ml，PBS,小皿，六孔板，蓝枪头，胶原酶，，无菌吸管，15ml离心管，50ml离心管，完全培养基（含10% FBS）\1640，DMEM/F-12，滤头，针管，筛网。

3. 仪器和软件

旋转混匀器，5%二氧化碳培养箱

四、实验操作

1. 将 3-4 周龄 C57/BL6 雄性小鼠引颈处死， 75% 酒精浸泡消毒5-10 min。

2. 沿背部双肾区剪开，无菌获取双肾，置于装有预冷的PBS的培养皿中，反复冲洗双肾。去除肾包膜和肾蒂组织。

 3. 将肾脏皮质与髓质分离，留下肾皮质在培养皿中用组织剪充分剪碎，并与低糖DMEM（DF-12） 混合后移入离心管中，1 500 r/min 离心 5min。

4. 去除离心管中的上清液，加入8 mL II 型胶原酶(1mg/mL; Worthington Chemical, Lakewood NJ)溶液至离心管中(0.1%(g/mL)，即称取0.01g II 型胶原酶加入10mL PBS(DF-12)中，然后用0.22μM滤器过滤)，反复吹打数次，将离心管放置于旋转混匀器（70 rpm）上37 °C消化20min。

5. 用无菌吸管将混悬液反复吹打数次后，取70 μm和40 μm的筛网，双重过滤细胞，去除未消化的肾组织（可再加一些培养基将未滤过点细胞流下）。

6. 向过滤后的细胞悬液中加入37 °C预热的完全培养基（含10% FBS）\1640培养基终止消化。加入与胶原酶等量培养基终止消化

7. 将上述细胞悬液150 g（200 r）离心10min, 去除上清液，在离心管的细胞沉淀中加入提前在 37 °C 预热的DMEM/F-12培养基，反复吹打数次使细胞重悬。接种到25 cm² 培养瓶后置入37 °C、5% CO₂培养箱内，12 h 内不宜晃动培养瓶。 48 h 后首次更换培养基，此后隔天更换1次

五、注意事项

1.尽量保证无菌操作，防止原代细胞被污染

2.操作难点为肾脏皮质和髓质分离（两种方法:去除髓质和剪取皮质），需多加练习

3.操作原代细胞时动作应轻柔，放入培养箱后12h不宜晃动

六、结果分析（可选）

七、参考文献（可选）

1. 王梨名,陈佳,陈客宏,蔡明玉,汪晓月,何娅妮.小鼠近端肾小管上皮细胞原代培养及鉴定[J].生理学报,2018,70(04):406-412.DOI:10.13294/j.aps.2018.0046.

2. Terryn S, Jouret F, Vandenabeele F, Smolders I, Moreels M, Devuyst O, Steels P, Van Kerkhove E. Aprimary culture of mouse proximal tubular cells, established on collagen-coated membranes. Am J Physiol Renal Physiol 2007; 293(2): F476–F485.