细胞划痕实验

一、视频摘要

细胞划痕实验是实验室分析细胞迁移能力的常用方法。 这种方法的原理是，当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。 划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。

二、关键词

细胞实验；细胞划痕；癌细胞

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

细胞

2. 试剂和耗材

直尺，DMEM培养基，移液枪

3. 仪器和软件

Image-j

四、实验操作

1. 培养板划线标记

　　用marker笔在6孔板背后画横线(用直尺比着)，每孔至少穿过5条线，每条线均匀且平行。

　　2. 细胞铺板

　　在孔内接种约5-10*105个细胞(可根据细胞的生长快慢调整接种数量)，原则为过夜后细胞能够长满，切记一定要铺匀。

　　3. 细胞划线

　　第二天用20uL枪头(灭菌)或牙签，垂直孔板背后的黑线划痕，使划痕与标记线相交。

　　4. 洗细胞，去除划下的细胞

　　划线完成后，使用无菌PBS洗细胞2-3次，去除划下的细胞，使留下的间隙肉眼即清晰可见，然后更换新鲜无血清或低血清(<2%)的培养基。

　　5. 细胞培养与观察

　　将细胞放入37℃，5%CO2培养箱中培养。然后在适当的时间点，如0，6，12，24小时后取出细胞，在显微镜下观察并拍照。

　　6. 数据分析

　　使用 Image J 软件打开图片后，随机划取 6 至8 条水平线，计算细胞间距离的均值。

五、注意事项

1，划痕实验一般选择6孔板，因为6孔板大小适中，可保证有相当距离的平直划痕，便于观察;当然若是需要高通量初筛时，也可以用12或者24孔板。

　　2，细胞的接种密度原则一般是过夜为100%融合，若过夜后细胞未100%融合，虽可以适当延长培养时间，但因细胞密度已经很大，所以细胞状态会逐渐变差，后续细胞可能不迁移而是凋亡。

　　3，降低细胞增殖对迁移造成的假阳性结果的方法：

　　① 使用无血清或低血清培养基(<2%)可降低细胞增殖对实验结果的影响; ② 一般认为24h为细胞的一个周期，在选取合适的时间点(6，12，24h)检测划痕宽度时，最好不要超过细胞一个周期的时间;③ 如果要单纯考虑细胞迁移，可以先用丝裂霉素(1μg/ml)处理1h，抑制细胞的分裂。

　　4，确保拍照的观察点固定：按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，划痕一次与5条定位线相交，就有10个可固定监测点，以解决了前后观察时位置不固定的问题。