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细胞划痕实验

白雪 |  2022-11-23  | DOI: 10.21769/BioProtoc.v1112
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视频简介细胞划痕实验是实验室分析细胞迁移能力的常用方法。这种方法的原理是,当细胞长到融合成单层状态时,在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域,称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。
  • 视频介绍

一、视频摘要

细胞划痕实验是实验室分析细胞迁移能力的常用方法。 这种方法的原理是,当细胞长到融合成单层状态时,在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域,称为“划痕”。 划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。


二、关键词

细胞实验;细胞划痕;癌细胞


三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

细胞


2. 试剂和耗材

直尺,DMEM培养基,移液枪


3. 仪器和软件

Image-j



四、实验操作

1. 培养板划线标记

  用marker笔在6孔板背后画横线(用直尺比着),每孔至少穿过5条线,每条线均匀且平行。

  2. 细胞铺板

  在孔内接种约5-10*105个细胞(可根据细胞的生长快慢调整接种数量),原则为过夜后细胞能够长满,切记一定要铺匀。

  3. 细胞划线

  第二天用20uL枪头(灭菌)或牙签,垂直孔板背后的黑线划痕,使划痕与标记线相交。

  4. 洗细胞,去除划下的细胞

  划线完成后,使用无菌PBS洗细胞2-3次,去除划下的细胞,使留下的间隙肉眼即清晰可见,然后更换新鲜无血清或低血清(<2%)的培养基。

  5. 细胞培养与观察

  将细胞放入37℃5%CO2培养箱中培养。然后在适当的时间点,如061224小时后取出细胞,在显微镜下观察并拍照。

  6. 数据分析

  使用 Image J 软件打开图片后,随机划取 6 8 条水平线,计算细胞间距离的均值。


五、注意事项

1,划痕实验一般选择6孔板,因为6孔板大小适中,可保证有相当距离的平直划痕,便于观察;当然若是需要高通量初筛时,也可以用12或者24孔板。

  2,细胞的接种密度原则一般是过夜为100%融合,若过夜后细胞未100%融合,虽可以适当延长培养时间,但因细胞密度已经很大,所以细胞状态会逐渐变差,后续细胞可能不迁移而是凋亡。

  3,降低细胞增殖对迁移造成的假阳性结果的方法:

  ① 使用无血清或低血清培养基(<2%)可降低细胞增殖对实验结果的影响; ② 一般认为24h为细胞的一个周期,在选取合适的时间点(61224h)检测划痕宽度时,最好不要超过细胞一个周期的时间;③ 如果要单纯考虑细胞迁移,可以先用丝裂霉素(1μg/ml)处理1h,抑制细胞的分裂。

  4,确保拍照的观察点固定:按照6孔板背后画线的垂直方向划痕,可以形成若干交叉点,划痕一次与5条定位线相交,就有10个可固定监测点,以解决了前后观察时位置不固定的问题。


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