IHC基本操作流程与注意事项

一、视频摘要

免疫组织化学技术（IHC）是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）。通过带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞与对应组织结合化学反应显色，对其进行定位、定性及定量的研究。 本视频简要介绍IHC的基本操作流程与注意事项。

二、关键词

免疫组织化学技术（IHC），抗原-抗体特异性结合，显色

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

2. 试剂和耗材

脱蜡剂即二甲苯、内源性过氧化物酶阻断剂、免疫染色封闭液、一抗、一抗稀释液、反应增强液、二抗、DAB显色试剂盒、柠檬酸或枸橼酸抗原修复液、PBS磷酸盐缓冲液、吐温-20

3. 仪器和软件

普通倒置光学显微镜

四、实验操作

（一）脱蜡和水化

配置90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇放于染色盒中，将石蜡切片置于55℃烘片机中1小时。打开通风橱柜，将组织切片分别在二甲苯I、二甲苯II、100%乙醇I、100%乙醇II、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中各放置5分钟（或根据具体实验室条件设置梯度酒精），去离子水浸泡载玻片3次，每次1分钟。

（二）抗原修复

在烧杯中加入提前稀释好的枸橼酸修复液，切片放于枸橼酸修复液中，一起加热至90°C，待加热至90℃，开始计时15分钟，期间维持煮沸温度90至95℃。取下烧杯，放置室温自然冷却40分钟。去离子水洗涤3次，每次5分钟。

（三）去除内源性过氧化物酶

吸水纸吸干切片四周水分，注意不能触及标本，切片放入湿盒，在标本周围用石蜡块画一圆圈，滴内源性过氧化物酶阻断剂至标本，室温孵育10分钟，去离子水洗涤3次，每次5分钟。

（四）封闭 

切片轻柔甩干，放入湿盒，滴加免疫染色封闭液，室温孵育20分钟。

（五）一抗孵育

一抗稀释液对一抗进行稀释，注意第一次实验时需设置抗体浓度进行条件摸索。吸水纸吸干切片四周水分，注意不要干片，滴加稀释好的一抗 ，4°C过夜孵育，约18小时，第二天取出，37°C复温30分钟。PBS与吐温-20比例为1000:1进行配制PBST，搅拌均匀。PBS-T浸洗3次，每次5分钟。

（六）二抗孵育

吸水纸吸干切片四周水分，注意不要干片，滴加反应增强液，37°C孵育20分钟，PBS-T浸洗3次，每次5分钟。吸水纸吸干切片四周水分，注意不要干片，滴加二抗，37°C孵育20分钟，PBS-T浸洗3次，每次5分钟。

（七）DAB显色

1滴浓缩DAB液与1 mlDAB底物液混合以配置DAB显色液，吹打均匀。提前设置好DAB显色时间，切片轻柔甩干，吸水纸吸干切片四周水分，放入湿盒。加适量新鲜配置的DAB显色液，室温孵育，注意DAB的孵育时间需根据具体实验进行摸索，同时需要必须精确到秒，因为孵育时间不同最终显色效果会有较大的差别。自来水冲洗3至5分钟终止染色。

（八）细胞核染色

苏木素染色液孵育20秒至3分钟，无需精确计时，自来水冲洗3至5分钟终止染色。

（九）返蓝

切片置于酸酒精中2秒，自来水冲洗2分钟，放于氨水中浸40秒，自来水冲洗2分钟，擦干切片四周及底部水分，显微镜下大致观察。

（十）脱水和透明

组织切片分别在70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、100%乙醇I、100%乙醇II、二甲苯I、二甲苯II中各放置5分钟。

（十一）封片

通风橱内晾置5分钟，中性树胶滴入标本正上方，盖上盖玻片，检查有无气泡干扰，待干燥后收起保存。

五、注意事项

（一）当初次使用某种一抗时，需进行预实验以确定抗体合适的稀释度。

（二）DAB的孵育时间需根据具体实验进行摸索，同时需要必须精确到秒，因为孵育时间不同最终显色效果会有较大的差别。

（三）抗原必须表达在特定部分才能定义为阳性。对于不在抗原所在部位的阳性着色，一律不能视为阳性。