一、视频摘要
结直肠癌（CRC）是世界上最常见的致命恶性肿瘤类型之一，其发病率和死亡率居世界第三位，是一种以代谢异常为重要特征的肿瘤，其发生发展与代谢密切相关。而溶酶体是汇聚多种细胞核心信号通路（如mTORC1, AMPK, JAK2-STAT3）的感应中枢，在营养感知、能量代谢过程中发挥着重要作用，因此检测活细胞中的溶酶体在结直肠癌代谢研究中非常重要。目前人们根据需要开发了一系列溶酶体检测试剂盒以简化检测程序，其中包括LysoTracker。LysoTracker探针，由荧光基团连接到一个弱碱性基团组成，其中仅弱碱基团可部分提供质子，以维持pH在中性值，这使LysoTracker探针可自由无阻地穿过细胞膜，特征性的聚集在球形细胞器，对酸性细胞器有高选择性，因此可用于活细胞溶酶体特异性荧光染色，便于我们更清晰地观察结直肠癌细胞中溶酶体数量的变化情况。
二、关键词
LysoTracker、溶酶体、结直肠癌、代谢
三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器
1. 样品信息
结直肠癌细胞HT29
2. 试剂和耗材
试剂：
1． LysoTracker™ Deep Red
2． PBS
3． DMEM/F12培养基
耗材：
1. 1ml枪头
2. BeyoGold™ 35mm玻底共聚焦培养皿(玻璃直径20mm)
3. 1ml移液枪
4. 冰盒
3. 仪器和软件
Cytomat™ 5 C 系列自动化培养箱、PerkinElmer UltraVIEW® VoX高速激光共聚焦实时成像系统
四、实验操作
1、将细胞提前一天种到共聚焦培养皿中，密度大概为10000个/皿
2、第二天提前用F12培养基配置LysoTracker混合液，推荐浓度为50-70nM
3、将种有细胞的共聚焦小皿拿出来，用1ml移液枪将培养基吸去，加入配置好的LysoTracker混合液，每皿1ml。
4、然后将共聚焦培养皿放到37摄氏度的细胞培养箱中避光孵育30分钟
5、孵育完成后，弃去培养基，加入1ml PBS。
6、最后用共聚焦显微镜进行拍照观察，选择激发波长范围为647/668。
五、注意事项
1、在用LysoTracker混合液孵育时需要避光。
2、不同细胞需要的LysoTracker浓度不一样，可以先做预实验确定最佳浓度。
3、LysoTracker孵育完成后并更换培养基为PBS，在拍照之前可先将共聚焦培养皿放在冰盒中保持细胞活性。
六、参考文献
[1] Ordureau A, Paulo JA, Zhang J, An H, Swatek KN, Cannon JR, Wan Q, Komander D, Harper JW. Global Landscape and Dynamics of Parkin and USP30-Dependent Ubiquitylomes in iNeurons during Mitophagic Signaling. Mol Cell. 2020 Mar 5;77(5):1124-1142.e10. doi: 10.1016/j.molcel.2019.11.013.
[2] Jakhria T, Hellewell AL, Porter MY, Jackson MP, Tipping KW, Xue WF, Radford SE, Hewitt EW. β2-microglobulin amyloid fibrils are nanoparticles that disrupt lysosomal membrane protein trafficking and inhibit protein degradation by lysosomes. J Biol Chem. 2014 Dec 26;289(52):35781-94. doi: 10.1074/jbc.
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