首页     短视频

Western blot的操作步骤

马岭, 远俊虎, 张帆宇王坦 |  2023-12-08  | DOI: 10.21769/BioProtoc.v1393
观看次数: 4 次  复制链接
视频简介蛋白质免疫印迹(Western blot ,WB),是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测,以下是WB操作步骤分享。
  • 视频介绍

一、视频摘要

蛋白质免疫印迹(Western blot),又称蛋白质免疫印迹法,是一种常用于研究中分离和鉴定蛋白质的技术。该技术首先利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对样品中的蛋白质进行分离。随后,通过转移将分离的蛋白质迁移到硝酸纤维素或聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。接下来,将膜与特异性抗体一起孵育,这些抗体能够识别并结合目标蛋白质。在洗涤膜的过程中,未结合的抗体被去除,只有与目标蛋白质结合的抗体留在膜上。最后,通过显影胶片或荧光扫描等方法检测和确定与目标蛋白质结合的抗体的存在。

二、关键词

Western blot、蛋白质、抗体

三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

2. 试剂和耗材

试剂:蛋白提取裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、聚丙烯酰胺凝胶、电泳缓冲液、卤化银染液等、PVDF膜、传卤槽、传卤海绵、转卤器、特异性抗体、辅助抗体、TBST缓冲液、蛋白质标记分子、显影液等。

耗材:离心管、移液枪、电泳槽、半干式转印装置、显微镜等。

3. 仪器和软件

电泳槽、电源、半干式转印装置或湿式转印装置、酶标仪、Chemiluminescence Imaging System、实验室离心机、摇床、ImageJ等。

四、实验操作

1. 蛋白质提取:从细胞或组织中提取蛋白质。需要使用蛋白提取缓冲液和蛋白酶抑制剂,同时可以利用超声细胞破碎仪进行样品破碎。

2. SDS-PAGE凝胶电泳:将分离后的蛋白质进行SDS-PAGE凝胶电泳,以分离出不同的蛋白质。需要准备聚丙烯酰胺凝胶、电泳缓冲液和卤化银染液等。

3. 转膜:将电泳分离后的蛋白质转移到PVDF膜上。需要准备传卤槽、传卤海绵、转卤器等。

4. 免疫印迹:将转移后的膜与特异性抗体一起孵育,这些抗体能够识别并结合目标蛋白质。同时需要准备辅助抗体、TBST缓冲液、蛋白质标记分子(如ECL试剂盒)、显影液等。

5. 显影:在洗涤膜的过程中,未结合的抗体被去除,只有与目标蛋白质结合的抗体留在膜上。最后,通过显影胶片或荧光扫描等方法检测和确定与目标蛋白质结合的抗体的存在。

6. 数据分析:使用数据分析软件进行Western blot结果的图像分析和数据处理。

五、注意事项

1. 样本的处理应该尽可能迅速,以防止蛋白质的降解和失活。在样本处理过程中,可以添加蛋白酶抑制剂和磷酸酯酶抑制剂来保护蛋白质的完整性。

2. 制备SDS-PAGE凝胶时,应根据目标蛋白的分子量选择合适的凝胶浓度和孔数。较小的蛋白质通常需要更高浓度的凝胶,而较大的蛋白质则需要更低浓度的凝胶。

3. 转膜过程中,确保将凝胶和膜保持湿润,以避免气泡的形成。此外,确保膜与凝胶紧密接触,以提高转膜效率。

4. 阻断步骤非常重要,可以使用牛血清蛋白(BSA)或非脂奶粉作为阻断缓冲液,选择合适的阻断缓冲液对于获得清晰的结果至关重要。

5. 确保一抗是特异性的,并且与目标蛋白有良好的结合能力。二抗应与一抗种属来源不同,并且与一抗有良好的交叉反应性。

6. 洗涤步骤的次数和洗涤缓冲液的选择对于降低非特异性结合至关重要。

声明:该视频作品仅代表作者观点,用于共享科学技术。内容仅供大家参考,不代表本站立场。