无饲养层法ips细胞的复苏、传代及悬滴法形成拟胚体

一、视频摘要

诱导多能干细胞（induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs）是类具有自我更新和多向分化能力的细胞，能够分化为内、中、外胚层。iPSCs为针对难治性疾病和损伤的细胞疗法提供了前所未有的机会，已用于临床试验^[1]。

实验原理：为了维持iPSCs的自我更新和多能性，需要严格的培养基和传代方法，才可以保持健康和未分化状态。常用的两种iPSCs培养系统分别是饲养层依赖型培养系统或无饲养层培养系统。在饲养层依赖性系统中胚胎成纤维细胞（Mouse Embryo Fibroblasts，MEFs） 通常被用作饲养细胞，饲养层细胞在维持多潜能细胞自我更新和多能性上可能起着两方面的作用，一是提供各种细胞因子，二是提供黏附面。无饲养层培养系统使用替代培养基，该培养基可提供iPSCs所需的所有生长因子；同时需要对培养板包被基质胶，使iPSCs贴壁^[2]。

ESC在1981 年发现，到了 1950当ESC注射到小鼠腹膜内时，观察到畸胎癌细胞形成有组织的异质聚集体的能力。 虽然畸胎癌可能包含多达 15 种分化细胞类型，但这些聚集体仅由两种或三种细胞类型组成； 一层内胚层 (VE) 有时会覆盖间充质，但并非总是如此，间充质中嵌入了未分化细胞的病灶。 这些聚集体被称为 EB。iPSCs也具有形成拟胚体的能力，也是iPSCs向其他细胞诱导分化时经历的经典途径^[3]。

实验目的：掌握iPSCs的无饲养层培养和传代方法，以及将iPSCs向其他方向诱导的拟胚体途径中悬滴法形成拟胚体的实验方法。

实验结果：iSPCs在无饲养层层法培养中保持未分化状态，细胞生长良好。悬滴法培养3天成功形成拟胚体。

二、关键词

诱导多能干细胞；无饲养层；拟胚体

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

iPSCs为血细胞重编程而来，于北京赛贝生物技术公司购买

2. 试剂和耗材

3. 仪器和软件

Nikon TS2-S-M倒置显微镜

四、实验操作

一、iPSCs复苏(参考赛贝生物人诱导多能干细胞（hiPSC）说明书)

1. 将mTESR1人多能干细胞完全培养基取出并平衡至室温，加入一定量的ROCK抑制剂使其浓度为10mM；取出包被过Matrigel工作液的培养皿，吸去包被液并加入适量mTESR1人多能干细胞完全培养基，置于37℃恒温CO²细胞培养箱中。

2. 37℃水浴解冻细胞，摇晃至细胞融化到仅剩一小块冰晶，转移至无菌操作台中。

3. 5ml枪头将细胞悬液转移至15mL离心管中，缓慢加入4mL含有ROCk抑制剂的 mTESR1人多能干细胞完全培养基，轻柔吹吸2次混匀。

4. 200g离心5分钟。

5. 弃上清，加入含有ROCk抑制剂的mTESR1人多能干细胞完全培养基重悬细胞，轻柔吹吸2次混匀，并接种到准备好的培养皿中，显微镜下观察细胞呈4 ~ 10个细胞大小的团块。

6. 水平十字摇匀，于室温放置10 ~ 15分钟。显微镜下观察到大部分克隆贴在皿底后，37℃恒温CO2细胞培养箱中。每天换液，贴壁后的细胞不再加含有ROCK抑制剂的mTESR1人多能干细胞完全培养基。

二、iPSCs的传代(参考赛贝生物人诱导多能干细胞（hiPSC）说明书)

1. 将mTESR1人多能干细胞完全培养基取出并平衡至室温，加入一定量的ROCK抑制剂使其浓度为10mM；取出包被过Matrigel工作液的培养皿，吸去包被液并加入适量mTESR1人多能干细胞完全培养基，置于37℃恒温CO2细胞培养箱中。

2. 吸走待传代细胞培养皿中的培养基，并且加入DPBS溶液洗一次。

3. 加入EDTA消化液使之完全覆盖培养皿。

4. 37℃恒温CO²细胞培养箱中孵育6~ 8分钟，显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离皿/瓶底，克隆内部大部分细胞间出现较为明显的间隙，肉眼观察到细胞集落变得不透明且发白，表明细胞消化时间理想。

5. 吸去消化液，加入新鲜的mTESR1人多能干细胞完全培养基，用移液器扇形吹打培养皿底，使细胞脱落，轻柔缓慢吹吸混匀。

6. 显微镜下观察细胞呈4 ~ 20个细胞大小的团块，水平十字摇匀。于室温放置10 ~ 15分钟。

7. 显微镜下观察到大部分克隆贴在皿底后将细胞置于37℃恒温CO2细胞培养箱培养，每天换液。

三、拟胚体的形成

1、细胞消化同上，弃去消化液，加入EB培养基，调整细胞悬液浓度，将含有 400-1000 个 iPSCs 细胞的 20-30 μL 液滴放在10cm皮氏培养皿的盖子上，平稳连续地移动盖子，将盖子小心地放在装有PBS的底座上，以防止液滴变干^[4]。

2. 非常轻轻地将盘子移入培养箱。 确保在处理 EB 生长的培养箱时格外小心：缓慢打开和关闭门，以确保液滴不会掉落或合并。

3. 将 EB 孵育 3 天，在在显微镜下观察可见圆形或类圆形的边界清楚的三维立体结构

五、注意事项

1、传代时要轻柔吹吸打皿底细胞，吹打混匀次数总共不超过10次为宜。

2、如有少量细胞无法从皿底脱落，属于正常现象。如有大量细胞无法从皿底脱落，需延长消化时间。

3、细胞传代时可不用加ROCK抑制剂

3、形成拟胚体的步骤中勿把皿盖提前润湿，否则液滴无法成形

六、结果分析（可选）

七、参考文献（可选）

[1]Yamanaka S. Pluripotent Stem Cell-Based Cell Therapy-Promise and Challenges[J]. Cell Stem Cell, 2020, 27 (4): 523-531.

[2]Robin L. Wesselschmidt, Jeanne F. Loring, CHAPTER 2 - Human Feeder Cells, Feeder-free, and Defined Culture Systems, Editor(s): Jeanne F. Loring, Robin L. Wesselschmidt, Philip H. Schwartz, Human Stem Cell Manual, Academic Press, 2007, Pages 18-33.

[3]Brickman JM, Serup P. Properties of embryoid bodies[J]. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology, 2017, 6 (2).

[4]Behringer R, Gertsenstein M, Nagy KV, et al. Differentiating Mouse Embryonic Stem Cells into Embryoid Bodies by Hanging-Drop Cultures[J]. Cold Spring Harb Protoc, 2016, 2016 (12).