植物微生物组DNA提取扩增及溯源分析
DNA Extraction, Amplification and Source-tracking Analysis for Plant Microbiomes   

材料与试剂

1.  一次性口罩、无菌手套及自封袋
2.  酒精棉球
3. 冰袋、干冰
4.  0.22 μm滤膜 (直径47 mm，Millipore)
5.  50 ml无菌离心管
6.  70%酒精、5.25%次氯酸钠溶液及无菌水
7.  液氮
8.  PowerSoil DNA提取试剂盒
9.  799F/1115R及fITS7/ITS4引物
10.  QIAquick纯化试剂盒
11.  无菌缓冲液 (0.1 M磷酸钾缓冲液，含0.1% 甘油和0.15% 吐温80，pH 7.0)
    

仪器设备

1.  剪刀及铁铲/土钻
2.  可移动保温箱/泡沫盒
3.  250 ml无菌玻璃瓶
4.  无菌研钵
5.  4/-40/-80 °C冰箱
6. 高压灭菌锅
7.  多联抽滤装置
8.  超声清洗仪
   
9.  摇床
10.  无菌工作台
11.  DNA提取及扩增相关设备 (如电子天平、细胞破碎仪、离心机、PCR仪等)
    

软件

1.  USEARCH v10
2.  QIIME v1.91
3.  SILVA数据库及UNITE数据库
4.  SourceTracker v1.0
   

实验步骤

一、植物和土壤样品采集

1.  采样前佩戴口罩及一次性无菌手套，不同小区间更换一次性手套，并使用酒精棉球对剪刀及铁铲/土钻进行消毒，避免交叉污染。
2.  以田间种植的玉米及小麦/大麦为例 (图1A)，每个小区随机选取约5株玉米及20-30株小麦/大麦，使用剪刀对每株植物中上部的1-2片健康叶 (各小区采集~50 g叶片) 进行采集。
3.  用铁锹尽可能完整挖出植物的整个根系，先小心去除根上携带的大块土壤，然后剧烈抖动获取紧密附着在根系上的土壤作为根际土壤，随后使用剪刀对植物根系 (各小区采集~20 g根) 进行采集。
4. 使用铁铲/土钻采集距离根系20 cm外的表层土 (0-15 cm) 作为非根际土壤，每个小区进行5点取样，混合均匀后作为一个生物重复。
5.  将采集得到的样品分装为分子样品 (如用于DNA提取的植物和土壤样品，使用干冰进行运输) 及普通样品 (如用于土壤理化性质测定的样品，使用冰袋进行运输)，尽快运输到实验室进行保存，分子样品放入-40/-80 °C冰箱冷冻保存，普通样品放入4 °C冰箱冷藏保存。

1.  对于植物表面微生物组DNA，将10-15 g叶片及3-5 g根 (如果表面附着大量土壤，可先使用无菌棉签小心去除) 放入带有无菌缓冲液 (0.1 M 磷酸钾缓冲液，含0.1% 甘油和0.15% 吐温80，pH 7.0) 的250 ml无菌玻璃瓶 (用于叶片，约150 ml缓冲液) 或50 ml无菌离心管 (用于根系，约35 ml缓冲液) 中。在40 kHz下超声1 min，然后在速度为200 rpm的摇床上震荡4 min对微生物细胞进行收集，这个过程重复2-3次。接着将带有微生物细胞的缓冲液通过0.22 μm滤膜 (可使用多联抽滤装置提高效率)，抽滤后得到的滤膜可放入无菌培养皿中在-40/-80 °C冰箱冷冻保存。在无菌工作台中使用无菌剪刀将滤膜剪碎后使用PowerSoil DNA 提取试剂盒按照说明书进行DNA提取。
2.  对于植物内生微生物组DNA，按上述方法处理去除植物表面大部分微生物细胞，将得到的叶片或者根系用无菌水洗净后进行下一步的表面消毒。主要步骤为：先放入70%酒精中浸泡5 min，再放入5.25%次氯酸钠溶液中浸泡5 min，然后放入70%酒精中浸泡30 s，最后用无菌水清洗至少5次避免酒精残留。使用液氮及无菌研钵对这些处理后的叶片及根系进行研磨，称取0.4 g粉末样品使用PowerSoil DNA 提取试剂盒按照说明书进行DNA提取。
3.  对于根际及非根际土壤DNA，称取0.4 g土壤样品使用PowerSoil DNA 提取试剂盒按照说明书进行DNA提取。

1.  采用799F/1115R引物 (Kembel et al., 2014) 对细菌16S rRNA V5-V6区进行扩增 (该引物可减少对植物叶绿体的扩增)，反应体系为25 μl，包含12.5 μl Premix Taq DNA聚合酶，0.5 μl前后引物 (10 μM)，2 μl模板DNA (~5 ng/μl)，以及9.5 μl PCR级别水。PCR扩增 (每个样品扩增3次后进行混合) 条件为：94 °C变性2 min，30个循环反应 (94 °C变性30 s，55 °C退火30 s及72 °C延伸45 s)，最后72 °C延伸10 min。
2.  采用fITS7/ ITS4引物 (White et al., 1990; Ihrmark et al., 2012) 对真菌ITS2区进行扩增，反应体系与细菌一致为25 μl。PCR扩增 (每个样品扩增3次后进行混合) 条件为：94 °C变性5 min，35个循环反应 (94 °C变性30 s，56.5 °C退火30 s及72 °C延伸30 s)，最后72 °C 延伸7 min。
3.  得到的PCR产物使用QIAquick纯化试剂盒进行纯化，下一步进行文库构建及高通量测序。

结果与分析

一、生物信息分析

1.  使用USEARCH 10 (Edgar, 2010) (软件及相关脚本：http://drive5.com/usearch/) 对扩增子测序数据进行分析，首先将引物序列及低质量 (Q score < 30) 序列末端去除 (-fastq_trunctail)，然后将双端序列拼接成单条序列 (-fastq_mergepairs)，并对这些序列进行下一步质控 (-fastq_filter, maximum expected error 0.5) 及去冗余 (-fastx_uniques) 分析。
2.  在USEARCH中使用UNOISE3 (-unoise3) 按100%相似度挑选正确的生物序列 (即zero-radius operational taxonomic units, ZOTUs)，并构建ZOTU表 (-otutab)。
3.  在QIIME 1.91 (Caporaso et al., 2010) (软件及相关脚本：http://qiime.org/scripts/index.html) 中使用BLAST算法将这些代表性序列与物种分类数据库 (细菌：SILVA数据库，真菌UNITE数据库) 进行比对 (assign_taxonomy.py)。
4.  对于细菌群落，去除得到的非细菌ZOTUs (包括叶绿体、线粒体及植物界相关的ZOTUs)。对于真菌群落，去除得到的非真菌ZOTUs (包括原生生物及植物界相关的ZOTUs) (filter_taxa_from_otu_table.py)。
5.  按所有样品中最低的序列数对ZOTU表进行抽平 (single_rarefaction.py)，抽平后的ZOTU表用于分析微生物群落的alpha/beta 多样性，或者也可以使用CSS (cumulative-sum scaling) 方法对ZOTU表进行标准化分析群落的beta多样性 (normalize_table.py)。

1.  为了构建植物微生物组来源模型 (Source Model of Plant Microbiome，SMPM)，首先基于已有的知识体系及植物不同部位微生物群落的潜在来源及互作关系构建植物微生物组来源概念模型 (即将不同部位的微生物群落设置为需要分析的目标样本及其潜在的来源) (图1B)。
2.  下载SourceTracker软件 (Knights et al., 2011) (官方软件及相关脚本：https://git hub.com/danknights/sourcetracker)，文件夹''sourcetracker-master''包括相关R脚本及数据格式，其中 ''README.md'' 文件中有相关使用教程及说明。
3.  以在QIIME中运行SourceTracker为例，根据sourcetracker-master/data/metadata.txt准备实验设计的表格，至少包括以下几列：1). '' SampleID '' (样品编号，与ZOTU表对应)；2). '' Env '' (样品分组，如植物不同的部位)；3). '' SourceSink '' (来源及目标)，其中将需要评估的目标样本命名为sink (如探究叶表的来源，所有来自叶表的样品分组名字为sink)，其次可能的微生物来源命名为source (如非根际土壤、根际土壤、根表等环境可能是叶表的潜在来源，其样品分组名字均为source)。
4.  根据sourcetracker-master/data/otus.txt准备ZOTU表格 (数值为整数，不能是相对丰度或小数)。
5.  在服务器中运行SourceTracker软件首先需要将SourceTracker文件夹路径存储在环境变量''SOURCETRACKER_PATH''中，脚本参考 ''README.md'' 文件中的说明。例如在分析目录下运行：''echo "" >> ~/.bash_profile; echo "export SOURCETRACKER_PATH=$HOME/Desktop/sourcetracker-master" >> ~/.bash_profile; source ~/.bash_profile'' ($HOME/Desktop/sourcetracker-master为分析目录地址)。
6.  根据构建的概念模型 (图1B)，分别运行SourceTracker脚本对模型中的各条来源关系进行计算及验证。例如首先探究叶表微生物组的来源，在metadata.txt文件中将'' SourceSink ''列下所有叶表样品命名为sink，其他潜在的来源如非根际土壤、根际土壤、根表等样品命名为source，然后进行分析。例如在虚拟机QIIME环境中运行的脚本为： ''R --slave --vanilla --args -i otus.txt -m metadata.txt -o sourcetracker_out < sourcetracker_for_qiime.r ''。
7.  重复第6条步骤，分别探究叶内、根表、根内等其他植物部位微生物组的潜在来源。SourceTracker软件主要基于贝叶斯算法，根据source样本和sink样本的群落结构预测sink样本中来源于各source样本的比例。
8.  根据 ''sourcetracker_out'' 输出文件夹下的分析结果计算植物各部位微生物组的平均潜在来源比率，对概念模型进行优化并赋值，绘制植物微生物组来源模型示意图 (图1C)。本文溯源分析所涉及的运行脚本、测试数据及视频教程已上传至GitHub (https://github.com/ChaoXiong2020/Source_tracking_Analysis)。
9.  基于此分析方法，可探究不同植物种类、不同生境、及不同生物 (如病害) 及非生物 (如干旱) 胁迫下植物微生物组 (如细菌、真菌、丰富物种、稀有物种、抗生素抗性基因等) 来源模式的变化，以揭示不同条件下植物-微生物互作的微生态过程及机制。
   
   
   图1. 土壤-植物连续体上微生物群落分布示意图.  (A) 宿主植物不同部位为微生物群落提供了不同的微生境 (生态位)；(B) 植物微生物组来源概念模型；(C) 基于溯源分析构建的植物微生物组来源模型。相关结果及示意图来自课题组先前发表的文章 (Xiong et al., 2021)。

致谢

本方案主要来源于课题组先前发表的相关文章 (Xiong et al., 2021; Xiong et al., 2021)。相关研究得到了中国科学院战略性先导专项B (XDB15020200)、国家重点研发计划项目 (2017YFD0200600) 和中科院青年创新促进会 (Y201615) 等项目的资助。

参考文献

1.  Caporaso, J., Kuczynski, J., Stombaugh, J., Stombaugh, J., Bittinger, K., Bushman, F. D., Costello, E. K., Fierer, N., Peña, A. G., Goodrich, J. K., Gordon, J. I., Huttley, G. A., Kelley, S. T., Knights, D., Koenig, J. E., Ley, R. E., Lozupone, C. A., McDonald, D., Muegge, B. D., Pirrung, M., Reeder, J., Sevinsky, J. R., Turnbaugh, P. J., Walters, W. A., Widmann, J., Yatsunenko, T., Zaneveld, J. and Knight, R. (2010). QIIME allows analysis of highthroughput community sequencing data. Nat Methods 7(5): 335-336.
2.  Edgar, R. C. (2010). Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics 26(19): 2460-2461.
3.  Ihrmark, K., Bodeker, I. T., Cruz-Martinez, K., Friberg, H., Kubartova, A., Schenck, J., Strid, Y., Stenlid, J., Brandstrom-Durling, M., Clemmensen, K. E. and Lindahl, B. D. (2012). New primers to amplify the fungal ITS2 region-evaluation by 454-sequencing of artificial and natural communities. FEMS Microbiol Ecol 82(3): 666-677.
4.  Kembel, S. W., O'Connor, T. K., Arnold, H. K., Hubbell, S. P., Wright, S. J. and Green, J. L. (2014). Relationships between phyllosphere bacterial communities and plant functional traits in a neotropical forest.Proc Natl Acad Sci U S A 111(38): 13715-13720.
5.  Knights, D., Kuczynski, J., Charlson, E. S., Zaneveld, J., Mozer, M. C., Collman, R. G., Bushman, F. D., Knight, R. and Kelley, S. T. (2011). Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking. Nat Methods 8(9): 761-763.
6.  White, T. J., Bruns, T., Lee, S. and Taylor, J. W. (1990). Chap. 1: Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J. and White, T. J. (Eds.). In: PCR Protocols. Academic Press, Inc., 315-322.
7.  Xiong, C., He, J. Z., Singh, B. K., Zhu, Y. G., Wang, J. T., Li, P. P., Zhang, Q. B., Han, L. L., Shen, J. P., Ge, A. H., Wu, C. F. and Zhang, L. M. (2021). Rare taxa maintain the stability of crop mycobiomes and ecosystem functions. Environ Microbiol 1462-2920.
   
8.  Xiong, C., Zhu, Y. G., Wang, J. T., Singh, B. K., Han, L. L., Shen, J. P., Li, P. P., Wang, G. B., Wu, C. F., Ge, A. H., Zhang, L. M. and He, J. Z. (2021). Host selection shapes crop microbiome assembly and network complexity. New Phytol 229(2): 1091-1104.