实验原理:细胞融合即细胞核来源于一个亲本,线粒体基因组或叶绿体基因组来源于另一个亲本的融合方式。在柑橘中,我们采用电融合。在交流电作用下,双亲原生质体迅速平行排成多个串珠,随后在直流电作用下,部分小串珠开始解体又融合在一起,形成新的圆球体。细胞融合能有效克服有性杂交不亲和以及远缘杂交障碍等困难,突破生殖隔离。
关键词: 基因组, 电融合, 原生质体
材料与试剂
- 滤纸
- 玻璃器皿 (90 mm)
- 双圈定性滤纸 (中速)
- 生根管
- 刀片
- 专用细胞培养皿
- 玻璃离心管
- 长吸管
- 0.22 μm醋酸纤维微孔滤膜
- 橡皮筋
- 封口膜
- 活性炭
- 锡箔纸
- 柑橘种子
- 柑橘胚性愈伤
- 75%酒精
- 3% NaClO
- NaOH
- FDA
- 纤维素酶R-10 (Yakult Honsha)
- 离析酶R-10 (Yakult Honsha)
- DMSO
- Sucrose
- 椰子汁20 ml
- 6-Benzylaminopurine (6-BA)
- Kinetin (KT)
- Naphthalene acetic acid (NAA)
- Indole-3-acetic acid (IAA)
- KOH
- KH2PO4
- KNO3
- MgSO4
- CuSO4
- CaCl2·2H2O
- NaH2PO4·2H2O
- 甘露醇
- BH3营养液配制所需试剂:
- 培养基相关母液 (见溶液配方)
- 培养基的配制 (见溶液配方)
仪器设备
- 酒精灯
- 镊子
- 三角瓶
- 刀柄
- 325目不锈钢过滤网筛
- 超净台
- 摇床
- 培养箱
实验步骤
- 材料的准备
- 原生质体的分离
- 原生质体的纯化
过夜酶解的原生质体经孔径为45 μm的不锈钢网筛去除未完全酶解的残渣,将滤液转移至无菌的10 ml玻璃离心管中,100 x g离心6 min,使原生质体沉于管底,去除上清液。之后向管内加入3 ml的CPW 13并用长吸管轻轻地吸打混匀,然后将液体吸出并缓慢加到事先加有6 ml CPW 26的10 ml离心管中,这一步骤动作一定要缓慢轻柔,避免产生太大冲击力,使CPW 13混合液悬浮于CPW 26液体上方,然后80 x g离心3 min进行界面梯度离心。完整的原生质体在CPW 13和CPW 26的分界面处出现一个清晰的环形带,其它杂质及少量原生质体沉于管底。
注:如果此种情况下无法形成界面,则原生质体沉淀物用CPW13悬浮,用长吸管将其吸出置于另一个无菌的10 ml离心管中 (将长吸管垂直插入离心管中吸取原生质体,勿倾斜),加入适量电融合液至6 ml并吸打混匀,100 x g离心6 min。去除上清液,加入适量的电融合液吸打混匀,在倒置显微镜下用血细胞计数板统计原生质体数目,然后用电融合液调整愈伤和叶肉原生质体的密度。一般来说,愈伤原生质体密度为1 x 106个/ml,叶肉原生质体密度2 x 106个/ml。
- 原生质体活性检查:利用FDA (二乙酸荧光素) 进行柑橘原生质体活力检测
- 原生质体融合-电融合法
- 融合细胞培养
将融合细胞采用BH3液体浅层培养,随着原生质体的生长发育,期间不断降低渗透压。待细胞团变成淡黄色时,转移至胚状体诱导培养基中,进一步增殖,之后诱导其生芽生根。
结果与分析
融合细胞圆球化后,采用BH3液体浅层培养融合细胞。培养15 d后,培养皿中出现了肉眼可见的白色的小颗粒,此时降低渗透压至0.45 M。培养25 d后,培养皿中出现较大细胞团,此时降低渗透压至0.3 M。培养至35 d后时,培养皿中出现致密的淡黄色小颗粒,将其转移至胚状体诱导培养基中,固液共培,弱光下继续培养,待胚状体长出转移至胚状体增殖培养基,胚状体迅速壮大、转绿。随后将长势良好的胚状体转移至生芽培养基继续培养,当再生芽长至有3-4片叶时,将其从胚状体上切下并转至生根培养基诱导生根。再生完整根系后,挑选根系健壮、生长势好的再生苗炼苗2周,最后移栽到温室。
注意事项
- 融合亲本状态最佳:悬浮细胞继代一周后状态最好,叶肉则在叶片充分成熟、展开,叶色浓绿时状态最好。
- 提取原生质体过程中,动作一定要轻缓,慢速。
- 原生质体融合过程中,叶片密度:愈伤密度 = 2:1。
溶液配方
一、培养基相关母液
- 6-BA储备液 (1 mg/ml)
6-BA 100 mg加入1.0 ml 1 M KOH搅拌至6-BA完全溶解,然后加蒸馏水定容到100 ml,4 °C保存
- KT储备液 (1 mg/ml)
KT 100 mg加入1.0 ml 1 M KOH搅拌至KT完全溶解,然后加蒸馏水定容到100 ml,4 °C保存
- IAA储备液 (1 mg/ml)
IAA 100 mg加入1.0 ml 1 M KOH搅拌至IAA完全溶解,然后用蒸馏水定容至100 ml,4 °C避光保存
- NAA储备液 (1 mg/ml)
NAA 100 mg加入1.0 ml 1 M KOH搅拌至NAA完全溶解,然后用蒸馏水定容到100 ml,4 °C避光保存
- 5 mg/ml FDA储备液
FDA5 mg溶解于1 ml DMSO中,用1.5 ml离心管装,-20 °C避光保存
- 1 M KOH储备液
KOH 5.6 g用100 ml蒸馏水溶解,室温保存
注:溶液配方7-12详见柑橘组织培养常用培养基配制方法 (杨雯惠等,2018)- 大量储备液
- 微量储备液
- 铁盐储备液
- 肌醇储备液
- 甘氨酸储备液
- 维生素储备液
- CPW盐储备液
CPW stock I母液
|
|
KH2PO4
| 0.272 g
|
KNO3
| 1.0 g
|
MgSO4
| 2.5 g
|
KI
| 0.002 g
|
CuSO4
| 0.00003 g
|
加蒸馏水定容至水,定容至100 ml,-20 °C避光保存
注: CPW stock II母液:CaCl2 1.5 g溶解于蒸馏水,定容至100 ml,-20 °C避光保存
- 酶母液储备液
CaCl2·2H2O
| 3.6 g
|
NaH2PO4·2H2O
| 0.14 g
|
溶解于蒸馏水,定容至100 ml,-20 °C避光保存
- CaCl2储备液 (100x)
CaCl2 0.2775 g溶解于蒸馏水,定容至100 ml,4 °C避光保存
二、培养基的配制
- MT固体培养基、悬浮培养基、播种培养基详见柑橘组织培养常用培养基配制方法。
- 0.6 mol/L EME培养基 (200 ml)
肌醇储备液 (100x)
| 2 ml
|
甘氨酸储备液 (100x)
| 2 ml
|
微量储备液 (100x)
| 2 ml
|
Fe2+-EDTA储备液 (100x)
| 2 ml
|
Vitamin B储备液 (100x)
| 2 ml
|
Vitamin C储备液 (100x)
| 2 ml
|
大量储备液 (10x)
| 20 ml
|
Sucrose
| 41.04 g
|
Malt Extract
| 0.1 g
|
加蒸馏水定容至200 ml,调pH至5.8,高压灭菌
- 0.15 M EME培养基 (200 ml)
肌醇储备液 (100x)
| 2 ml
|
甘氨酸储备液 (100x)
| 2 ml
|
微量储备液 (100x)
| 2 ml
|
Fe2+-EDTA储备液(100x)
| 2 ml
|
Vitamin B储备液 (100x)
| 2 ml
|
Vitamin C储备液 (100x)
| 2 ml
|
大量储备液 (10x)
| 20 ml
|
Sucrose | 10.26 g
|
Malt Extract
| 0.1 g
|
加蒸馏水定容至200 ml,调pH至5.8,高压灭菌
- 胚状体诱导培养基
肌醇储备液 (100x)
| 10 ml
|
甘氨酸储备液 (100x)
| 10 ml
|
微量储备液 (100x)
| 10 ml
|
Fe2+-EDTA储备液(100x)
| 10 ml
|
Vitamin B储备液 (100x)
| 10 ml
|
Vitamin C储备液 (100x)
| 10 ml
|
大量储备液 (10x)
| 100 ml
|
Sucrose
| 50 g
|
Malt Extract
| 0.5 g
|
加蒸馏水定容至1,000 ml,调pH至5.8,高压灭菌
- 胚状体增殖培养基
肌醇储备液 (100x)
| 10 ml
|
甘氨酸储备液 (100x)
| 10 ml
|
微量储备液 (100x)
| 10 ml
|
Fe2+-EDTA储备液(100x)
| 10 ml
|
Vitamin B储备液 (100x)
| 10 ml
|
Vitamin C储备液 (100x)
| 10 ml
|
大量储备液 (10x)
| 100 ml
|
Sucrose
| 50 g
|
Malt Extract
| 1.5 g
|
加蒸馏水定容至1,000 ml,调pH至5.8,高压灭菌
- CPW13 (100 ml)
CPW stock I
| 1 ml
|
CPW stock II
| 1 ml
|
甘露醇
| 13 g
|
加蒸馏水定容至100 ml,调pH至5.8,高压灭菌
- CPW25 (100 ml)
CPW stock I
| 1 ml
|
CPW stock II
| 1 ml
|
蔗糖 | 25 g
|
加蒸馏水定容至100 ml,调pH至5.8,高压灭菌
- 酶1 (愈伤组织) (40 ml)
纤维素酶R-10
| 0.48 g
|
离析酶R-10
| 0.48 g
|
甘露醇
| 5.1 g
|
酶母液
| 4 ml
|
加蒸馏水定容止40 ml,调pH至5.8,通过0.22 μm醋酸纤维微孔滤膜过滤灭菌
- 酶2 (试管苗叶片) (40 ml)
纤维素酶R-10
| 0.6 g
|
离析酶R-10
| 0.6 g
|
甘露醇
| 5.1 g
|
酶母液
| 4 ml
|
加蒸馏水定容止40 ml,调pH至5.8,通过0.22 μm醋酸纤维微孔滤膜过滤灭菌
- 电融合液 (100 ml)
甘露醇
| 12.75 g
|
CaCl2 (100x) 母液
| 1 ml
|
加蒸馏水定容止100 ml,调 pH 至 5.8,高压灭菌
- 生芽培养基
肌醇储备液 (100x)
| 10 ml
|
甘氨酸储备液 (100x)
| 10 ml
|
微量储备液 (100x)
| 10 ml
|
Fe2+-EDTA储备液 (100x)
| 10 ml
|
Vitamin B储备液 (100x)
| 10 ml
|
Vitamin C储备液 (100x)
| 10 ml
|
大量储备液 (10x)
| 100 ml
|
1 mg/ml 6-BA
| 500 μl
|
1 mg/ml KT
| 500 μl
|
1 mg/ml NAA
| 100 μl
|
Source
| 40 g
|
Agar
| 8 g
|
加蒸馏水定容至1,000 ml,调pH至5.8,高压灭菌
- 生根培养基
肌醇储备液 (100x)
| 10 ml
|
甘氨酸储备液 (100x)
| 10 ml
|
微量储备液 (100x)
| 10 ml
|
Fe2+-EDTA储备液 (100x)
| 10 ml
|
Vitamin B储备液 (100x)
| 10 ml
|
Vitamin C储备液 (100x)
| 10 ml
|
大量储备液 (10x)
| 50 ml
|
1 mg/ml IBA
| 100 μl
|
1 mg/ml NAA
| 500 μl
|
Source
| 25 g
|
Agar
| 8 g
|
活性炭
| 0.5 g
|
加蒸馏水定容至1,000 ml,调pH至5.8,高压灭菌
- BH3营养液配方

加蒸馏水定容至1,000 ml,用KOH调pH至5.8,通过0.22 μm醋酸纤维微孔滤膜过滤灭菌
参考文献
- 郭文武. (1998). 柑橘细胞电融合及其再生植株遗传变异研究[D]. 武汉: 华中农业大学图书馆.
- 肖诗鑫. (2014). 柑橘胞质杂种创制及原生质体再生过程的细胞学研究[D]. 武汉: 华中农业大学图书馆.
- 杨雯惠,解凯东,郭文武. (2018). 柑橘组织培养常用培养基配制方法. Bio-101 e1010184. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010184.
- Grosser, J. W., Gmitter, F. G., Louzada, E. S. and Chandler, J. L. (1992). Production of somatic hybrid and autotetraploid breeding parents for seedless citrus development. HortScience 27(10): 1125-1127.
- Guo, W. W. and Deng, X. X. (1998). Somatic hybrid plantlets regeneration between Citrus and its wild relative, Murrayapaniculata via protoplast electrofusion. Plant Cell Rep 18(3-4): 297-300.
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.