骨骼肌肌肉干细胞流式分选
Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells by FACS   

材料与试剂

1. 10 cm dish
2. 培养皿
3. 离心管
4. 封口膜
5. 移液管
6. 10 ml注射器
7. 20 G针头
8. 40 μm滤膜
9. FACS管
10. 小鼠
11. 马血清 (Hyclone, catalog number: SH30074.03) 
12. Collagenase II (Worthington, catalog number: LS004177)
13. Dispase (Life Technologies, catalog number: 17105-041)
14. CD31-APC (Clone MEC13.3, BioLegend, catalog number: 102510, 4 °C)
15. CD45-APC (Clone 30-F11, BioLegend, catalog number: 103112, 4 °C)
16. Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Anti-Sca1，clone D7, BioLegend, catalog number: 108120, 4 °C) 
17. Biotin anti-mouse CD106 (Anti-vascular cell adhesion molecule 1 (anti-VCAM 1)，clone 429, BioLegend, catalog number: 105704, 4°C) 
18. F-10 (Gibco, catalog number: 11550-043)
19. Penicillin-streptomycin mixture (Hyclone, catalog number: SV10030)
20. PE/Cy7 streptavidin (BioLegend, catalog number: 405206, 4 °C)
21. 乙醇
22. PI
23. Wash medium (WM) (见溶液配方)
    
24. Muscle dissociation buffer (MDB) (见溶液配方)
25. Stock collagenase II solution (见溶液配方)
26. Stock  dispase solution (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 移液枪
2. 眼科剪
3. 尖头镊子
4. 手术刀
5. ZWY恒温水浴培养振荡器 (上海智城分析仪器制造有限公司，model: ZWF-110X30)
6. 水平离心机 (Thermo Scientific，model: labofuge 400 R)
7. 高速流式细胞分选仪-Aria Sorp (BD，FACS Aria SORP)
   

实验步骤

一、肌肉解剖 (15~20 min/只小鼠，6周龄~28月龄均可)

1. 一只小鼠准备一个10 cm dish，在每个10 cm dish中加入10 ml WM。
2. 将小鼠安乐死。
3. 将小鼠尸体用70%乙醇喷湿，腹部朝上放在解剖台上。
4. 用镊子夹起脚踝周围的皮肤，剪一个小切口。
5. 剥开腿部皮肤，使后腿肌肉全部暴露出来，如图1所示。
   
   
   图1. 小鼠后肢骨骼肌
   
   
6. 取下所有后腿肌肉，放入准备好的10 cm dish中，并剔除肌间脂肪。
7. 如果实验需要也可将前肢的三头肌解剖下来。
8. 将肌肉转移至一个新的培养皿中，用镊子固定肌肉的一端，然后用手术刀将肌肉切成薄片。这一步骤应在10 min内完成。
   注：此步骤目的在于尽可能增加肌肉组织与消化液的接触面积，提高消化效率。

1. 将切好的薄片状肌肉组织转移至50 ml离心管中，加入10 ml MDB。
   注：一个离心管内最多放置两只小鼠的肌肉量，即20 ml MDB。
2. 用封口膜将离心管封好，水平固定在37 °C恒温水浴摇床上 (平行于摇床运动方向，并完全浸没于水中)，60~70 rpm，1 h。
3. 在每个离心管中加入预冷的WM至50 ml，轻柔地上下颠倒混匀。
4. 用水平离心机4 °C 500 x g离心5 min。弃上清，在管底留8 ml。
5. 加入1 ml stock collagenase II solution和1 ml stock dispase solution。
6. 用5 ml移液管将沉淀重悬，吹吸10~15次或吹吸至没有阻力即可。
7. 用封口膜将离心管封好，水平固定在37 °C恒温水浴摇床上 (平行于摇床运动方向，并完全浸没于水中)，60~70 rpm，30 min。
8. 用10 ml注射器和20G的针头吹吸十次。
   注：将液体吹到管壁上，避免气泡。
9. 在每个离心管中加入预冷的WM至50 ml，轻柔地上下颠倒混匀。
10. 用水平离心机4 °C 500 x g离心5 min。弃上清，在管底留10 ml。
    
11. 取一个干净的50 ml离心管，准备好40 μm滤膜。
12. 用10 ml的移液管把沉淀重悬，自然过滤。
13. 在沉淀管里加10 ml WM，清洗离心管后过滤。
14. 另取10 ml WM冲洗滤膜。用200 μl的移液枪将滤膜底部残留的液体转移到离心管里。
15. 在每个离心管中加入预冷的WM至50 ml，轻柔地上下颠倒混匀。
16. 用水平离心机4 °C 500 x g离心5 min。立刻彻底吸干上清。
注：不要吸到沉淀。
17. 用600 μl WM 重悬细胞沉淀，计数。约8~12 x 10⁶个细胞/只小鼠。

1. 在5 ml的FACS管中加入190 μl WM，取10 μl细胞悬液放入其中，作为未染样品。
2. 取3个1.5 ml离心管，做好标记，每管中加入190 μl WM和10 μl细胞悬液。按照表1进行染色 (作为单染样品)：
   
   表1. 单染样品染色
   
   
   
3. 将剩余所有细胞悬液转移至一个1.5 ml离心管中 (即实验组)，加入抗体VCAM1、CD31、CD45、Sca1，各5 μl/只小鼠。
4. 将所有的样品固定在rocker上，最低转速，4 °C，40 min。
5. 每管加WM至1.5 ml，轻柔地上下颠倒数次混匀。用固定角转子4 °C 250 x g离心5 min。
6. 彻底弃上清，单染组用200 μl WM 重悬细胞沉淀，实验组用500 μl WM重悬。
7. 在VCAM1单染组细胞中加入0.5 μl PE/Cy7。 
8. 在实验组细胞中加入5 μl PE/Cy7和1 μl PI (PI终浓度为0.3 μg/ml)。将所有的样品固定在rocker上，最低转速，4 °C，20 min。
9. 将除VCAM1单染管外的其他单染管置于冰上避光备用。
10. 在染了PE/Cy7的每个离心管中加入WM至1.5 ml，轻柔地上下颠倒数次混匀。用固定角转子4 °C 250 x g离心5 min。
11. 彻底弃上清，VCAM1单染组用200 μl WM 重悬细胞沉淀，并40 μm过滤后转移至5 ml的FACS管中。
12. 实验组用500 μl WM 重悬，并40 μm过滤后转移至5 ml的FACS管中。
13. 另取500 μl WM 冲洗实验组的1.5 ml离心管，将洗涤液同样40 μm过滤后转移至5 ml的FACS管中，注意将滤膜上的残液吸净。然后再取1 ml WM 加入FACS管中，轻柔混匀。
    

1. 选用70 μm喷嘴。
2. 调电压。
3. 上单染组样品，调补偿，确保阳性群清晰。
4. 用15 ml的离心管装5 ml WM收集CD31⁻CD45⁻Sca1⁻VCAM+的细胞群，如图2所示。
   
   
   图2. CD31⁻CD45⁻Sca1⁻VCAM⁺的细胞群分选. A. P5为CD31⁻CD45⁻Sca1⁻的细胞群。B. P6为CD31⁻CD45⁻Sca1⁻VCAM⁺的细胞群。C. CD31⁻CD45⁻Sca1⁻VCAM⁺的细胞群在单核细胞混合悬液中占比4.0%。
   

注意事项

1. 从小鼠安乐死到肌肉切成薄片放入MDB中，全程最好保证15 min内完成。
2. 肌肉组织要保证切成均匀的薄片，否则消化不彻底会造成肌肉干细胞损失。
3. 消化过程中注意观察，待消化至无片状组织后，及时终止消化，否则会导致肌肉干细胞死亡。
   

溶液配方

1. Wash medium (WM)
   F-10 + 10%HS (horse serum，马血清)
   1x PS (青霉素-链霉素双抗)，冰上备用
2. Muscle dissociation buffer (MDB)
   700~800 U/ml collagenase II溶液 (溶剂为WM) 10 ml/只小鼠
   现用现配，冰上备用
3. Stock collagenase II solution
   将collagenase II粉末溶于1x PBS至终浓度1,000 U/ml
   0.22 μm过滤，分装成1 ml/tube，-20 °C保存
4. Stock  dispase solution
   将dispase粉末溶于1x PBS至终浓度11 U/ml
   0.22 μm过滤，分装成1 ml/tube，-20 °C保存，三个月内用完
   

致谢

感谢香港科技大学Tom H Cheung博士共同讨论肌肉干细胞分选方法。感谢中国科学院生物化学与细胞生物学研究所细胞平台的边玮、王雪冬、丁宇波、俞珺璟老师在分选仪器使用中的帮助。感谢中国科学院器官重建与制造战略性先导科技专项 (XDA16021400)，科技部重点研发计划 (2017YFA002700)，自然科学基金委员会(91649104，31671536)，NN-CAS Foundation，上海市科委 (Y753S11802，18ZR1446300) 的资助。