柑橘组织冰冻切片
Cryosectioning Method for Citrus Tissue    

材料与试剂

1. 毛刷
   
2. 载玻片
   
3. 柑橘果皮
   
4. 包埋剂 (O.C.T. Compound SAKURA Tissue-Tek, calalog number: 4583)
   
5. 液氮
   
6. 乙醇
   
7. 乙酸
   
8. 蔗糖
   
9. 甘油
   
10. PBS
    

仪器设备

1. 单面刀片
   
2. 冰冻切片机 (Leica, model: CM1950)
   注：CM1950冰冻切片机使用说明见附录。
   

实验步骤

1. 材料处理
   根据不同材料特性，可以选用不同的处理方式：
   1.1

   将材料分割成合适大小，不超过5 mm³，浸没于包埋剂1-5 min，时间不要太久，液氮速冻30 s-1 min或者放于冰冻切片机内速冻模块上速冻。
   
   1.2

   将材料分割成合适大小，不超过5 mm³，放于卡诺固定液 (纯乙醇15 ml，乙酸5 ml) 中，固定24 h后，由低浓度到高浓度换不同浓度保护剂 (常用蔗糖保护剂或甘油) 处理材料，再将材料浸没包埋剂中，液氮速冻30 s-1 min包 埋。
   注 (常用保护剂)：
   10%蔗糖保护剂：10 g蔗糖 + 100 ml PBS
   15%蔗糖保护剂：15 g蔗糖 + 100 ml PBS
   
2. 修块、切片、粘片：将包埋好的材料粘在样品托上，用遇冷的刀片修整包埋块到合适大小进行切片，切片厚度一般10-14 µm。将切片粘附于干净的载玻片上。
   注：
   1)

   OCT冻结后变得不透明，修块时要注意样品位置。
   
   2)

   可以用室温下的载玻片靠近切片，切片会自动粘附上。
   
3. 染色 (选做)
   用蒸馏水洗去切片上的包埋剂。将切片转入染色液中染色，用吸水纸擦拭干载玻片底面以及周围，置显微镜上观察。