柑橘石蜡切片
Paraffin Embedding Citrus Tissues and Sectioning   

材料与试剂

1. 纱布
   
2. 棕色瓶
   
3. 烧杯
   
4. 纸
   
5. 吸管
   
6. 盖玻片
   
7. 载玻片
   
8. 毛笔
   
9. 乙醇
   
10. 乙酸
    
11. 甲醛
    
12. 青霉素小瓶
    
13. 二甲苯
    
14. 石蜡
    
15. 洗洁精
    
16. 多聚赖氨酸
    
17. 染缸
    
18. 苏木精
    
19. 铁矾
    
20. 中性树胶
    
21. 盐酸
    
22. 福尔马林
    
23. 卡诺固定液 (见溶液配方) 
    
24. FAA固定液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 真空泵
   
2. 4 °C冰箱
   
3. 烘箱
   
4. 水浴锅
   
5. 60-65 °C恒温箱
   
6. 包埋机 (Thermo Fisher Scientific, model: EC350-1) 
   
7. 半自动轮转切片机 (Thermo Fisher Scientific, model: HM340E) 
   
8. 摊片机 (Taiva, model: TK-218) 
   
9. 通风橱
   

实验步骤

1. Day 1，取样固定 (保持组织在活体状态下的成分和结构)
   卡诺或者FAA固定液固定装于青霉素小瓶中的材料，抽真空30 min，室温下24 h，4 °C存储过夜。
   
2. Day 2，脱水 (除去组织内的水分，使细胞组织变硬，也便于透明剂进入细胞内)
   30%乙醇 → 50%乙醇 → 70%乙醇，各脱水1.5 h。材料在70%乙醇中过夜或者4 °C长期保存。
   
3. Day 3，继续脱水、透明、透蜡
   3.1

   70%乙醇中过夜的材料继续脱水；85% (1.5 h) → 95% (1.5 h) → 100% (1 h) → 100% (1 h)。
   注：为了使材料脱水彻底，纯乙醇要换2次，每次1 h。
   
   3.2

   1/5二甲苯 + 4/5乙醇 (1 h) → 2/5二甲苯 + 3/5乙醇 (1 h) →3/5二甲苯 + 2/5乙醇 (1 h) → 4/5二甲苯 + 1/5乙醇 (1 h) → 纯二甲苯 (1 h) → 纯二甲苯 (1 h)。在装有材料的小瓶上画5格刻度线，每次吸取一格加入二甲苯，直至纯二甲苯。
   
   3.3

   透蜡：透蜡注意从低浓度到高浓度，从低温到高温，使石蜡慢慢透入组织中。将二甲苯吸出，仅剩没过材料的二甲苯，加入碎蜡至瓶满，碎蜡完全融化，再加入碎蜡，直至瓶满，透蜡过程逐步升温，37 °C → 42 °C → 58 °C (可不用)，透蜡持续三天。
   
4. Day 7，纯蜡透蜡、包埋
   4.1

   用纯蜡继续透蜡，换液体纯蜡3次，每次3 h，包埋 (此处在60-65 °C恒温中进行，依蜡熔点而确定)。提前将蜡放到60-65 °C恒温箱中融化备用。
   
   4.2

   使用包埋机进行包埋，叠小盒子并作标记，将纸盒注入适量的蜡 (依材料大小而定)。然后转至包埋机的冷冻台上，待小盒底部已有一层蜡固定时，加入材料并摆放好位置。
   
5. Day 8，载玻片处理
   5.1

   盖玻片、载玻片经洗洁精清洗或者10%盐酸泡过夜后，浸泡于95%乙醇中，晾干，将1 mg/ml的多聚赖氨酸 (PLL) 稀释成终浓度0.1 mg/ml (10 ml母液加90 ml的蒸馏水)。
   
   5.2

   在染缸内用PLL (粘片) 处理载玻片20-30 min；取出晾干，装入盒内4 °C保存。
   
6. Day 9，切片、展片、粘片
   6.1

   切片前先修整蜡块，先将蜡块削成梯形，便于底部与蜡块相接，材料周围留 1-2 mm蜡。
   
   6.2

   利用半自动轮转切片机制作切片，调整好蜡块定位器与切片定位器之间的距离，设置切片厚度 (8-10 μm)。
   
   6.3

   旋转手柄，选取理想材料的切片迅速放入TK-218型恒温摊片烤片机的摊片水盘中，摊片机温度设置均为39-40 °C。
   
   6.4

   待蜡片在水中完全展开后，用多聚赖氨酸处理过的载玻片从水中慢慢捞出蜡带，使其平展在玻片上，置于烘片栏上烘干 (水滴烘干)，37 °C烘箱中烘片48 h (可根据材料调整烘片的时间)。
   注：

   1)

   切片蜡带有纵痕现象，很可能是刀上粘有小碎蜡，可取下刀片用二甲苯擦拭。
   

   2)

   切片前可将修好的蜡块放在冰上，有助于形成蜡带，切片卷曲时可调整刀片的角度。
   

   3)

   由于温度较高且材料较大，切片易卷曲，摊片时易出现褶皱，摊片动作要迅速。
   
7. Day 12，染色、封片
   7.1

   染色前将染液配好，苏木精需要一段时间的成熟过程，所以可以提前2-4周配好，用纱布包好瓶口，放在通风处。成熟后放在棕色瓶避光保存。使用时以原液一份 (150-200 ml) 加入50%乙醇 (150 ml) 与乙酸 (150 ml) 混合，染液 可回收利用多次。
   注：苏木精不用配置，可直接购买。
   
   7.2

   二甲苯脱蜡2次 (每次1 h) → 二甲苯:无水乙醇 = 1:1 (10 min) → 复水 (100%-95%-85%-70%-50%-30%各级乙醇，高 → 低，每次5 min) → 4%铁矾媒染 (现配现用10 min) → 水洗 (5 min) → 苏木精染色 (染色时间依情况而定) → 自来水冲洗至返蓝 → 脱水 (各级乙醇30%-50%-70%-85%-95%-100%，每次2-3 min) → 二甲苯:无水乙醇 = 1:1 (10 min) → 二甲苯透明2次 → 封片 (树胶封片，并盖上盖玻片，晾干，可长期保存)。
   注：因二甲苯有毒，挥发性强，因此以上步骤需在通风橱中进行。封片后一定要等到二甲苯挥发完后再取出。
   

溶液配方

1. 卡诺固定液
   无水乙醇:乙酸=3:1
   
2. FAA配方 (1 L)
   福尔马林100 ml，乙酸30 ml，50%乙醇870 ml混匀