果蝇Schneider 2细胞免疫荧光染色
Immunohistochemistry of Drosophila Schneider 2 Cell   

材料与试剂

1. 移液枪头
2. 24孔细胞培养板 (Thermo Fisher Scientific, Nunc, catalog number: 140675)
3. 15 ml塑料离心管 (Thermo Fisher Scientific, Nunc, catalog number: 339650)
4. 1.5 ml离心管 (Corning, AXYGEN, catalog number: MCT-150-C)
5. 载玻片 (Thermo Fisher Scientific, Superfrost AA00008032E00MNT10)
6. 盖玻片 (Thermo Fisher Scientific, CB00100RA120MNT0)
7. 封口膜 (VWR Life Science, Parafilm, catalog number: PM-996)
8. 果蝇S2细胞
9. 质粒：pUAST-V5-misshapen，pActin-Gal4
10. 磷酸缓冲液干粉 (1× PBS) (Coolaber, catalog number: PM-5090-50)
11. 75%酒精 (ANNJET，75%酒精消毒液)
12. 去离子水
13. 多聚甲醛 (paraformaldehyde, PFA) (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: 441244) 4 °C保存
14. Triton X-100 (VWR Life Science, AMRESCO, catalog number: 0694)
15. 小牛血清蛋白 (VWR Life Science, AMRESCO, catalog number: 0332) 4 °C保存
16. 多聚赖氨酸母液 (Poly-L-lysine solution) (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: P4832) 4 °C保存
17. 刀豆蛋白A (Concanavalin A) (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: C5275) -20 °C保存
18. 封片剂 (Maravai LifeSciences, Vector Laboratories, VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI H-1200) 4 °C保存
19. (可选) 80%甘油
20. 指甲油 (SEPHORA, OPI, catalog number: 5708)
21. 一抗mouse anti-V5 (Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, catalog number: 46 0705) 浓度1:2,000
22. 二抗Goat anti-mouse 488 (Thermo Fisher Scientific, Alexa Fluor^® Plus 488, catalog number: A32723)
23. 磷酸缓冲液(1× PBS) (见溶液配方)
24. 多聚赖氨酸溶液 (见溶液配方)
25. 刀豆蛋白A溶液 (见溶液配方)
26. 4%多聚甲醛-PBS溶液 (见溶液配方)
27. 0.1% Triton X-100-PBS溶液 (见溶液配方)
28. 0.2%小牛血清蛋白-PBS溶液 (见溶液配方)
29. 一抗溶液 (见溶液配方)
30. 二抗溶液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 镊子 (赛拓，1380)
2. 移液枪 (Gilson, P1000, P200, P10)
3. 荧光显微镜 (Leica, model: DM IL LED)
4. 共聚焦显微镜 (Leica, model: TCS SP8)
5. 细胞培养箱 (SANYO, model: MCO-18AIC)：有恒温功能和保湿功能即可，温度设定为25 °C，湿度设定为70%。果蝇S2细胞不需要通入CO₂
6. 摇床 (Kylin Bell，orbital shaker TS-1)
7. 层析柜 (松源华兴，SL-II型数控层析冷柜)
8. 恒温水浴锅 (Thermo Fisher Scientific, ISOTEMP 202)
9. 电子天平 (Mettler Toledo, model: PL602-S)
   

实验步骤

1. 观察细胞状态
   从培养箱中取出需要进行免疫荧光染色的细胞，并在显微镜下观察，细胞密度为0.5~1 × 10⁶/ml比较合适。
   
2. 细胞贴壁
   由于S2细胞为半悬浮细胞，贴壁能力较差，我们在显微观察和染色处理的过程中需要采取使其贴附在盖玻片上。通常采用的方法是使用多聚赖氨酸或刀豆蛋白A预处理盖玻片。多聚赖氨酸可以使S2细胞贴附盖玻片的同时保持其球状的细胞形态。刀豆蛋白A在使S2细胞贴壁的同时也会使其扁平延展 (Rogers等，2002)。
   
   2.1

   准备圆形盖玻片若干，用75%酒精清洗后晾干。
   2.2

   用镊子把盖玻片放在24孔细胞培养板内，用移液枪在盖玻片上加100 μl多聚赖氨酸或刀豆蛋白A溶液，并把溶液均匀涂在盖玻片上。静置1分钟。
   2.3

   吸去多聚赖氨酸或刀豆蛋白A溶液 (可回收使用)，待盖玻片干透后，加入500 μl吹吸混匀的细胞培养液。把24孔细胞培养板放回细胞培养箱，等待细胞贴附在盖玻片上。使用多聚赖氨酸处理玻片时这一过程需要2小时，刀豆蛋白A溶液处理玻片时这一过程需要1小时。
3. 细胞的免疫组化染色
   
   3.1

   取出24孔细胞培养板，吸去培养基上清。加入0.5 ml PBS溶液清洗，然后吸去PBS溶液。
   3.2

   在孔中加入200 μl 4%多聚甲醛-PBS溶液，室温静置15分钟，然后吸去上清。
   3.3

   加入0.5 ml PBS溶液清洗3次，吸去上清后加入200 μl 0.2%小牛血清蛋白-PBS溶液，室温静置45分钟。
   3.4

   吸去上清，加入0.5 ml 0.1%Triton^TM X-100-PBS溶液，静置5分钟。
   3.5

   配好含有一抗的0.2%小牛血清-PBS溶液。准备一个空的枪头盒，取下枪头网格，在盒内放置一张合适大小的湿润的滤纸或注入高约1 cm的双蒸水，再放置上枪头网格。在枪头网格上放置合适大小的封口膜，用移液枪吸取30 μl含抗体的溶液，点在封口膜上。取出带有细胞的盖玻片，将有细胞的一面向下盖在封口膜的溶液上。合上枪头盒盖，把枪头盒放入4 °C层析柜中过夜。湿润的枪头盒能保证抗体孵育的过程中抗体溶液不会蒸发。
   3.6

   取出盖玻片，有细胞的一面朝上放入24孔细胞培养板中，用0.5 ml PBS溶液清洗3次，PBS溶液每次在盖玻片上停留5分钟。
   3.7

   每张盖玻片上加入100 μl含有二抗的0.2%小牛血清蛋白-PBS溶液，在摇床上室温孵育1小时，如果使用的二抗为带有荧光标记的二抗，室温孵育需要避光处理。
   3.8

   吸去上清，用0.5 ml PBS溶液清洗3次，PBS溶液每次在盖玻片上停留5分钟。
4. 制片与成像
   
   4.1

   准备一张载玻片，用移液枪在载玻片中间加入5 μl封片剂。
   4.2

   用镊子把带有细胞的盖玻片取出，贴有细胞的一面朝下把玻片轻轻地盖在载玻片的封片剂上，尽量避免产生气泡。
   4.3

   在盖玻片边缘涂上一圈指甲油，以固定盖玻片。
   4.4

   待指甲油晾干后，使用激光共聚焦显微镜成像。

结果与分析

我们在S2细胞中转染了pUAST-V5-misshapen以及pActin-Gal4质粒各0.4 μg，并在转染2天后收集细胞做免疫荧光染色，使用刀豆蛋白A处理玻片。使用一抗mouse anti-V5 (Invitrogen) 浓度1:2,000。使用二抗Goat anti-mouse 488 (Thermo Fisher Scientific Alexa Fluor^® Plus 488) 浓度1:400。结果显示Misshapen蛋白主要分布在S2细胞的细胞质中 (图1)。


图1. V5-misshapen过表达细胞染色

注意事项

1. 细胞的状态会影响其形态和贴壁的能力，一般情况下请尽量保证实验前细胞状态良好，密度合适。
2. 细胞受到挤压和摩擦时形态会被破坏，转移带有细胞的盖玻片时需要时刻注意，不要把带有细胞的一面朝下。
3. 使用Triton^TM X-100-PBS溶液对细胞进行透化处理，对于细胞内部结构的染色是必需的。但是处理的时间过长会导致细胞内部蛋白组分的损失。因此在常规染色中，透化处理不超过5分钟。而在细胞骨架蛋白的染色中，则需要比较长的时间的透化处理，洗掉多余的蛋白，这时可以在一抗溶液和二抗溶液中也加入0.1%Triton^TM X-100。
4. 根据抗体的不同，一抗溶液和二抗溶液的浓度以及孵育时间都有可能不同。对于一些信号不是很特异的抗体，建议使用果蝇组织进行预处理：在PBS缓冲液中解剖果蝇三龄幼虫。具体流程请参照“果蝇翅成虫盘免疫荧光染色” (高远等，2019) 中组织解剖部分。将解剖完毕的果蝇组织置于1.5 ml离心管中，加入200 μl 4%多聚甲醛-PBS溶液并于室温固定20 min。去除固定液后用1× PBS溶液清洗3次，加入配制好的抗体溶液至于4 °C摇床孵育过夜。收集的上清即为预处理的抗体溶液，可以有效提高抗体的特异性，降低显色背景。 
5. 如果一抗和二抗的信号不强，可以适当延长孵育的时间。但是要注意孵育时间过长可能会导致抗体溶液的挥发，从而影响染色效果。
6. 由于Vectashield封片剂本身含有DNA染料DAPI，所以上述方案没有提到细胞核染色方法。如果没有Vectashield mounting medium可以用80%甘油代替，这时需要在二抗孵育液中加入DAPI染料进行细胞核染色。在甘油中荧光信号很快会淬灭，必须在封片完成后2天以内进行成像。
   

溶液配方

1. 磷酸缓冲液(1× PBS)
   1 L装磷酸缓冲液干粉加入去离子水中混匀，定容至1 L
   室温保存
   
2. 多聚赖氨酸溶液
   准备一个干净的15 ml塑料离心管，加入9 ml去离子水
   向管中加入1 ml多聚赖氨酸溶液母液，上下颠倒混匀
   4 °C保存
   
3. 刀豆蛋白A溶液
   准备一个无菌的1.5 ml离心管，加入1 ml 1× PBS溶液，将5 mg刀豆蛋白A加入到含有1 ml PBS溶液的离心管中，用移液枪吹吸混匀，配制为刀豆蛋白A溶液
   -20 °C保存
   
4. 4%多聚甲醛-PBS溶液
   称取4 g多聚甲醛干粉加入100 ml 1× PBS溶液中，混匀
   用NaOH调节pH为7.0
   分装在无菌的1.5 ml离心管中，每管1 ml
   由于多聚甲醛溶解性不是很强，如果长时间不溶解，可以在37 °C恒温水浴锅中处理2小时
   -20 °C保存
   
5. 0.1% Triton X-100-PBS溶液
   1 L 1× PBS溶液中加入1 ml 0.1% Triton X-100
   室温保存
   
6. 0.2%小牛血清蛋白-PBS溶液
   称取0.20 g小牛血清蛋白加入100 ml 1× PBS溶液中，混匀后分装在无菌的1.5 ml离心管中，每管1 ml
   -20 °C保存
7. 一抗溶液
   将一抗按适当比例加入到0.2%小牛血清蛋白-PBS溶液中，现用现配
   
8. 二抗溶液
   将二抗按比例加入到0.2%小牛血清蛋白-PBS溶液中，现用现配
   

致谢

本实验室的工作得到细胞增殖与分化重点教育部重点实验室、膜生物学国家重点实验室、生命科学联合中心、国家自然科学基金和科学技术部的资金支持。本实验方案改编自本实验室的发表文章Du等 (2016) 和Liu等 (2016)。

参考文献

1. 高远，刘敏，朱健. (2019). 果蝇翅成虫盘免疫荧光染色. Bio-101 e1010260. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010260.
2. Du, J., Zhang, J., He, T., Li, Y., Su, Y., Tie, F., Liu, M., Harte, P. J. and Zhu, A. J. (2016). Stuxnet facilitates the degradation of polycomb protein during development. Dev Cell 37(6): 507-519.
3. Liu, M., Li, Y., Liu, A., Li, R., Su, Y., Du, J., Li, C. and Zhu, A. J. (2016). The exon junction complex regulates the splicing of cell polarity gene dlg1 to control Wingless signaling in development. Elife 5: e17200.
4. Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J. and Vale, R. D. (2002). Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol 158(5): 873-884.