摘要:免疫荧光染色可以通过抗原-抗体特异性结合,对特定蛋白进行标记,随后通过检测荧光,对蛋白表达甚至蛋白定位进行直观、可视化的观察。免疫荧光染色可以分为一步法和两步法,一步法使用直接带有荧光基团的特异性一抗,适用范围较小,两步法则较为常用,即首先通过特异性抗体结合特定蛋白 (一抗),随后用带有荧光基团的抗体特异性结合一抗,进而使被一抗标记的蛋白可以在荧光显微镜下被观察到。果蝇翅成虫盘是果蝇幼虫中的组织,由一层单层柱状上皮和一层单层扁平上皮组成,在果蝇发育过程中,翅成虫盘会发育成果蝇成虫翅膀。果蝇翅成虫盘的发育受到Notch,Wnt,Hedgehog,Dpp,Hippo等多种信号转导通路共同调控,是研究信号转导通路的理想模型。本文将通过对果蝇翅成虫盘上Wg蛋白的免疫荧光染色实验,详细描述果蝇翅成虫盘解剖及免疫荧光染色的实验步骤及注意事项。
关键词: 黑腹果蝇, 翅成虫盘, 免疫荧光染色
材料与试剂
- 载玻片 (帆船牌载玻片, 7105)
- 盖玻片 (CITOGLAS, 10212020C)
- 1.5 ml塑料离心管 (Corning, AXYGEN, catalog number: MCT-150-C)
- 4%多聚甲醛 (Paraformaldehyde, PFA) (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: 441244)
- 磷酸缓冲液 (1× PBS) (Coolaber, catalog number: PM5090)
- Triton X-100 (VWR Life Science, AMRESCO, catalog number: 0694)
- 牛血清蛋白BSA (VWR Life Science, AMRESCO, catalog number: 0332)
- Wg抗体 (DSHB, 4D4)
- 山羊抗小鼠IgG 568 nm荧光二抗 (Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, catalog number: A-11004)
- 甘油 (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: G5516)
- 指甲油 (SEPHORA, OPI, 5708)
- 封片剂 (Maravai LifeSciences, Vector Laboratories, VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI, H-1200)
- Schneider果蝇培养基 (Thermo Fisher Scientific, Gibco, catalog number: 21720-024)
- PBST (见溶液配方)
- PBST-BSA (见溶液配方)
仪器设备
- 解剖镊 (Regine, Venus, 5)
- 解剖显微镜 (Leica, S6E)
- 脱色摇床 (杭州米欧, RH-24)
- 4 °C低温层析冷柜 (松源华兴,SL-II型数控层析冷柜)
- 移液器 (Gilson, P2-P1000)
- 激光扫描共聚焦显微镜 (Leica, model: TCS SP8)
实验步骤
- 组织解剖和固定
- 孵育抗体
- 制片和成像
注:对于一些特殊需求的免疫荧光染色的特殊操作:
- 对于需要进行3D重构的翅成虫盘染色
由于翅成虫盘正常厚度约为45 μm左右,而一般情况下压片后压片厚度只有15 μm,因此翅成虫盘细胞会被机械力挤压导致其在z轴方向上较为密集。因此,对于需要拍摄3D重构的果蝇翅成虫盘,可以在制片时进行如下操作:
- 对于暴露于细胞膜外的蛋白染色
对于一些在翅成虫盘细胞中分泌或作为配体在细胞表面起作用的蛋白,可以通过对其进行细胞外染色进行观察。在进行细胞外染色时,应保持细胞在孵育一抗结束前仍然存活,使细胞膜结构完整,令抗体无法通过自由扩散进入细胞内;同时要尽可能阻断细胞膜的流动性,防止抗体通过细胞的内吞作用进入到细胞内 (Liu等,2016)。具体操作如下:
结果与分析
本实验结果反映了Wg蛋白在果蝇翅成虫盘中的表达模式 (图2)。果蝇翅成虫盘分为前段 (Anterior) 和后端 (Posterior),或背侧 (Ventral) 和腹侧 (Dorsal)。Wg蛋白在翅成虫盘总主要表达在背-腹边界线 (D-V Boundary) 上,并向两侧分泌,形成浓度梯度。
图2. 果蝇翅成虫盘中Wingless (Wg) 蛋白表达模式
注意事项
- 信号弱或无信号
- 信号强或噪音过高
- 其他
溶液配方
- PBST
1× PBS
0.1% Triton X-100 - PBST-BSA
1× PBS
0.1% Triton X-100
0.2% BSA
致谢
本实验室的工作得到细胞增殖与分化重点教育部重点实验室、膜生物学国家重点实验室、生命科学联合中心、国家自然科学基金和科学技术部的资金支持。本实验方案改编自本实验室的发表文章Du等 (2016) 和 Liu等 (2016)。
参考文献
- Du, J., Zhang, J., He, T., Li, Y., Su, Y., Tie, F., Liu, M., Harte, P. J. and Zhu, A. J. (2016). Stuxnet facilitates the degradation of polycomb protein during development. Dev Cell 37(6): 507-519.
- Liu, M., Li, Y., Liu, A., Li, R., Su, Y., Du, J., Li, C. and Zhu, A. J. (2016). The exon junction complex regulates the splicing of cell polarity gene dlg1 to control Wingless signaling in development. Elife 5: e17200.
Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.