果蝇雌性生殖干细胞免疫组织化学染色
Immunohistochemistry for Drosophila Female Germline Stem Cells   

材料与试剂

1. 移液枪头
2. 2 ml离心管
3. 载玻片
4. 盖玻片
5. 雌性成体果蝇
6. 指甲油
7. 37%甲醛 (formaldehyde, Sigma, catalog number: F1635)
8. NaH₂PO₄
9. Na₂HPO₄
10. NaCl
11. 甘油
12. DABCO (1,4-Diazabicyclo[2,2,2]octane)
13. Triton^TM X-100
14. 羊血清 (NGS)
15. 一抗 (特异性结合目标蛋白)：大鼠抗Vasa (DSHB, anti-vasa)，小鼠抗alpha-Spectrin (DSHB, 3A9)
16. 二抗 (带有荧光基团，特异性结合一抗)：Alexa 568大鼠抗IgG (Molecular Probes)，Alexa 488小鼠抗IgG (Molecular Probes)
17. DAPI (4’,6’-diamidino-2-phenylindole; Sigma)
18. 磷酸缓冲液 (1× PBS, pH 7.4) (见溶液配方)
19. PBT (1×) (见溶液配方)
20. 封片剂 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 镊子 (WPI^®，Dumoxel合金镊子，#5 14098)
2. 移液器
3. 解剖板
4. 解剖显微镜 (Leica L2)
5. 摇床
6. 通风橱
7. 荧光显微镜 (Zeiss Meta 510)
   

实验步骤

一、组织解剖和固定

1. 挑选较年轻的雌性成体果蝇，用二氧化碳麻醉。
2. 在多孔板中倒入PBS，在解剖显微镜下用镊子将卵巢从果蝇腹部取出，尽可能去除周围的脂肪，肠道等组织，加入带有500 μl PBS的2 ml离心管中。
3. 在通风橱中加入甲醛至甲醛4%的体积比，放置在摇床上，在室温下固定15分钟。
4. 使用移液器在通风橱中尽可能地吸去4%甲醛溶液。
5. 使用PBT洗去残留的甲醛溶液，洗三次，每次放置在摇床上5分钟。
   
   

二、免疫组化染色

1. 吸去清洗的PBT，加入新300 μl PBT。
2. 加入羊血清至5%体积比，用于封闭。
3. 加入两种一抗，大鼠抗Vasa (1:200)、小鼠抗α-Spectrin (1:200) 放在放置在摇床上4 °C孵育过夜。
4. 使用移液器尽可能多的吸去一抗溶液，并用PBT洗去残留的溶液，洗三次，每次放置在摇床上5分钟。
5. 吸去清洗的PBT，加入新的300 μl PBT。
6. 加入两种二抗，Alexa568大鼠抗IgG (1:300)、Alexa488小鼠抗IgG (1:300) 放在摇床上常温避光孵育2小时。
7. 使用PBT洗去残留的二抗，加入新300 μl PBT，并加入1 μl DAPI染色，放置在摇床上，常温避光染色5分钟。
8. 使用PBT洗三次每次放置在摇床上5分钟。
9. 吸去清洗的PBT，加入30 μl封片剂，放入4 °C孵育半小时。
   
   

三、制片与成像

1. 在解剖显微镜下放置一片载玻片。
2. 用移液器将卵巢和20 μl左右封片剂一起转移至载玻片上。
3. 在镜下用镊子剔去较大的卵细胞，留下卵巢前端，并将其轻轻分开，让卵巢小体 (ovariole) 分散在载玻片上。
4. 将盖玻片轻压在载玻片上，让封片剂填充满载玻片与盖玻片间空隙，再放上纸巾轻压，使得多余液体挤出并用纸巾吸干。如有液体不足，可用移液器补加适量封片剂，再重复步骤4。
5. 之后可以用指甲油密封盖玻片边缘，待指甲油晾干后，用荧光显微镜成像观察。
   

结果与分析

果蝇雌性生殖干细胞位于卵巢前部，原卵区的最前端，由它产生的子细胞经过一系列不完全分裂发育成16细胞的包囊细胞，并被卵泡细胞包裹成为卵室并出芽离开原卵区，在后续过程中其16个中的一个细胞发育为卵母细胞，其他细胞分化为滋养细胞合成卵黄成分，而滋养细胞本身也在之后分解凋亡，最终仅剩下一个卵细胞，形成成熟的卵。这一系列的生殖细胞系，均可通过Vasa蛋白的表达特异识别。通过对Vasa蛋白的免疫组织化学染色，可以明显观察到在原卵区的生殖细胞系的分化进程 (图1B)。并且DAPI能够将整个原卵区细胞的染色质染色 (图1A)。这使得我们通过将DAPI和Vasa的染色结果相结合 (图1A, 1B)，观察到不属于生殖细胞的体细胞类群，而这些体细胞帮助构成了生殖干细胞干性维持和发育的微环境。
       在原卵区里，果蝇雌性生殖干细胞收到微环境提供的Dpp信号调控，抑制生殖细胞分化所需的Bam基因表达，维持干细胞干性。而干细胞一旦离开提供Dpp信号的微环境，Bam基因的抑制解除，从而促使果蝇雌性生殖干细胞分化。而后续分化过程中，生殖细胞特征的细胞器结构spectrosome也会随之变化。生殖干细胞中的spectrosome常呈球形或棒状结构，细胞分裂后形成融合体 (fusome) 联通16细胞，帮助这其中的物质运输和卵母细胞形成 (Song等，2004)。而spectrosome中包含的α-Spectrin蛋白可以作为标记追踪spectrosome及之后的融合体的形态 (图1C)，并帮助观察果蝇雌性生殖干细胞的后续分化过程 (Lin和Spradling，1995)。
       除了正常免疫染色信号以外，免疫染色有时也会染上一些杂质，影响结果。在原卵区免疫染色中，有时会残留有附着原卵区的结构，例如鞘细胞。这些细胞很容易附着上抗体，造成假阳性的免疫荧光信号，需要注意区别，尽量选择特异性好的抗体。

图1. 果蝇卵巢原卵区免疫组化染色结果. A. DAPI染色细胞核；B. Vasa蛋白免疫组化染色，结合的是Alexa 488小鼠抗IgG；C. α-Spectrin蛋白免疫组化染色，结合的是Alexa568大鼠抗IgG；D. 各个通道染色结果叠加图像。

注意事项

一、荧光信号弱或无信号

1. 一抗与二抗不匹配
   选用与一抗来源物种对应的二抗
   
2. 一抗或二抗浓度过低
   适当增加抗体浓度
   
3. 抗体存储不当或污染导致失效
   及时替换新抗体
   
4. 样品量过多
   减少每管的样品量，每管尽量不超过5对卵巢
   
5. 样品在固定前放置时间过长
   可以将解刨后组织浸泡在PBS中并插在冰上暂时保持一段时间 (不超过3小时) 至样品固定前
   
   

二、背景信号过强或非特异性识别

1. 一抗或二抗浓度过高
   适当降低抗体浓度
   
2. 孵育一抗或二抗后，未洗净多余抗体
   增加洗涤次数
   
3. 羊血清出现沉淀或变质，导致封闭效果不佳
   换用新的羊血清
   
4. 制片后长时间未进行成像
   制片后尽快进行成像，或者放到-20 °C保存
   

溶液配方

1. 磷酸缓冲液 (1× PBS, pH 7.4)
   10 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄
   175 mM NaCl
2. PBT (1×)
   1× PBS
   0.1% Triton^TM X-100
3. 封片剂
   70%甘油
   2% DABCO
   28% 1× PBS (v/v)

致谢

本文实验方案改编自发表文章Li等 (2010) 和 (2016)。

参考文献

1. Li, X., Han, Y. and Xi, R. (2010). Polycomb group genes Psc and Su(z)2 restrict follicle stem cell self-renewal and extrusion by controlling canonical and noncanonical Wnt signaling. Genes Dev 24(9): 933-946.
2. Li, X., Yang, F., Chen, H., Deng, B., Li, X. and Xi, R. (2016). Control of germline stem cell differentiation by Polycomb and Trithorax group genes in the niche microenvironment. Development 143(19): 3449-3458.
3. Lin, H. and Spradling, A. C. (1995). Fusome asymmetry and oocyte determination in Drosophila. Dev Genet 16(1): 6-12.
4. Song, X., Wong, M. D., Kawase, E., Xi, R., Ding, B. C., McCarthy, J. J. and Xie, T. (2004). Bmp signals from niche cells directly repress transcription of a differentiation-promoting gene, bag of marbles, in germline stem cells in the Drosophila ovary. Development 131(6): 1353-1364.