果蝇幼虫唾液腺组织中线粒体荧光蛋白标记观察
Observation of Mitochondrial Fluorescent Protein Markers in Drosophila Larvae Salivary Gland Tissues   

材料与试剂

1. 培养皿
2. 载玻片和盖玻片
3. (可选) 过滤灭菌器
4. EP管
5. 锡箔纸
6. 果蝇样本
7. 甘油
8. 指甲油
9. NaCl
10. KCl
11. Na₂HPO₄
12. KH₂PO₄
13. HCl
14. 多聚甲醛
15. 1× PBS缓冲液 (见溶液配方)
16. 4% PFA溶液 (见溶液配方)
17. DAPI母液 (20 ng/μl) (见溶液配方)
18. 0.1 M磷酸钠缓冲液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 解剖镊
2. (可选) 高压蒸汽灭菌锅 
3. -20 °C冰箱
4. 激光共聚焦显微镜或者荧光显微镜 (Leica, model: Leica SP8)
   

实验步骤

1. 将带有sqh-EYFP-Mito的果蝇亲本 (BL7194) 与待检测的果蝇亲本杂交；幼虫在实验条件下饲养到三龄幼虫Wandering时期。
   注：若用UAS-GFP，购买BDSC果蝇编号为BL8442。实验条件温度若无GAL4系统则用25 °C培养，若用UAS-GAL4系统，则用29 °C培养。
   
2. 在PBS缓冲液中用解剖镊解剖三龄幼虫分离唾液腺组织；将组织放置于含有PBS缓冲液的染色皿中。
3. 吸干PBS缓冲液，用4%多聚甲醛 (PFA) 在室温下固定30 min。
4. 吸干PFA溶液，用PBS清洗3次。每次10 min。
5. 按照1:10稀释20 ng/μl DAPI母液，并染色5 min。
6. 吸走DAPI，用PBS清洗3次。
7. 80%甘油压片，用指甲油封片。
8. 用激光共聚焦显微镜或者荧光显微镜扫描样品 (图1)。检测光谱为EYFP检测光谱，激发光488 nm波长。
   
   
   图1. 果蝇唾液腺细胞mito-EYFP
   

溶液配方

1. 1× PBS缓冲液
   137 mM NaCl
   2.7 mM KCl
   10 mM Na₂HPO₄
   2 mM KH₂PO₄
   用800 ml蒸馏水溶解8 g NaCl，0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4 和0.24 g KH₂PO₄。用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水至1 L。分装后在15 psi (1.05 kg/cm²) 高压蒸汽灭菌20 min，或通过过滤除菌，保存至室温
2. 4% PFA
   10 g多聚甲醛溶解在0.1 M磷酸钠缓冲液 (250 ml)，加热60 °C搅拌至澄清，调整pH到7.4
   
3. DAPI母液
   1 mg/ml
   10 mg DAPI粉末加入100 ml双蒸水中配置成1 mg/ml母液，分装在10个EP管中，用锡箔纸包裹，置于-20 °C冰箱保存。实际使用时，将母液1:5,000稀释
4. 0.1 M磷酸钠缓冲液
   3.0 g NaH₂PO₄, 14.2 g Na₂HPO₄，溶解到1,250 ml蒸馏水中
   

参考文献

1. LaJeunesse, D. R., Buckner, S. M., Lake, J., Na, C., Pirt, A. and Fromson, K. (2004). Three new Drosophila markers of intracellular membranes. Biotechniques 36(5): 784-788, 790.