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沉积物、岩石样品总DNA提取
Total DNA Extraction from Sediment and Rock Samples   

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摘要:本实验流程在土壤总DNA提取方法上,通过对破碎、DNA分离和纯化步骤的优化,能够有效提高从环境样品中获得总DNA的浓度和质量。此方法适用于不同环境样品中总DNA的提取,包括淡水、潮间带沉积物和海洋沉积物,以及岩石等低生物量的环境样品。所获得的DNA可以用于扩增16S rRNA基因和功能基因,功能基因定量以及宏基因组测序。

关键词: 酚氯仿法, DNA提取, 沉积物, 岩石

材料与试剂

  1. 2 ml、15 ml和50 ml离心管 (Axygen, catalog number: MCT-200-C; SCT-15ML-25-S; SCT-50ML-25-S)
  2. 药匙 (无菌)
  3. NaH2PO4 (Sigma, catalog number: S3139)
  4. Na2HPO4 (Sigma, catalog number: S3264)
  5. EDTA (pH = 8.0, Sigma, catalog number: 324506)
  6. Tris-HCl (pH = 8.0, Solarbio, catalog number: T8230)
  7. NaCl (Sigma, catalog number: S3014)
  8. CTAB (Sigma, catalog number: 52365)
  9. 蛋白酶K (Sigma, catalog number: 70663)
  10. 溶菌酶 (Sigma, catalog number: L6876)
  11. SDS (Sigma, catalog number: L3771)
  12. 苯酚-氯仿-异戊醇 25:24:1 (pH > 7.8, Sigma, catalog number: 77617)
  13. Polydexoyinosinic-deoxycytidylic acid (poly dI-dC) (Sigma, catalog number: P4929)
  14. 异丙醇 (Sigma, catalog number: I9516)
  15. 1× TE缓冲液 (pH =8.0) (生工,catalog number:B548106)
  16. DNeasy® PowerSoil® Kit (Qiagen, catalog number: 12888-100)
  17. DNA抽提缓冲液 (1L) (见溶液配方)
  18. 20 % SDS (十二烷基磺酸钠) (见溶液配方)
  19. 3 M醋酸钠 (pH 5.2) (见溶液配方)
  20. 0.5 ug/ul Poly (dl-dC) (见溶液配方)

仪器设备

  1. 组织研磨机 (Tissuelyser-48, 上海净信公司,中国)
  2. 离心机 (5810R,Eppendorf公司,德国)
  3. 涡旋仪 (Vortex Genie® 2 Vortex,MO BIO公司,美国)
  4. 水平24 × 1.5 ml离心管支架 (SI-H524,MO BIO公司,美国)
  5. 移液枪 (10 μl, 200 μl, 1 ml, Eppendorf公司,美国)
  6. 紫外交联仪 (Stratalinker 1800 UV,Stratagene公司,美国)
  7. 高压蒸汽灭菌锅 (G154DWS,致微 (厦门) 仪器有限公司,中国)
  8. 鼓风干燥箱 (DHG-9091A,上海一恒科学仪器有限公司,中国)
  9. 马弗炉 (MFLX544-12,上海马弗炉科技仪器有限公司,中国)
  10. 0.22 μm 滤膜 (SLGP033RB,Merck Millipore公司,爱尔兰)
  11. 酒精喷壶
  12. 冰箱 (MDF-U74V,Panasonic公司,日本)
  13. Nanodrop (Nano-300,杭州奥盛仪器有限公司,中国)
  14. 电磁加热搅拌器 (TH-500,上海沪西分析仪器厂,中国)
  15. 耐高温磁性搅拌子

实验步骤

一、 沉积物样品 (Zhou et al, 1996; Natarajan et al, 2016)

  1. 在2 ml Ep管中加入0.3 g粒径为0.1 mm的玻璃砂,之后加入适量沉积物 (一般0.3 g~0.5 g湿重);
  2. 加入650 μl的DNA抽提缓冲液,在打碎前需要将沉积物和缓冲液混匀,此步骤需在涡旋仪上安装水平离心管支架,将离心管放在离心管架上,一般选择5档,振荡3~5 min;
  3. 将离心管放入组织研磨机中,30 Hz,打碎30 s,打碎三次,每次间歇120 s,然后加入70 μl溶菌酶 (起始浓度20 mg/ml)和20 μl蛋白酶K (起始浓度20 mg/ml),缓慢上下颠倒几次来混匀,37 °C温育30 min,每隔10 min混匀,缓慢颠倒混匀即可,不要过度振荡;
  4. 加入70 μl 20 % SDS混匀,缓慢上下颠倒几次来混匀,65 °C温育2 h,每隔30 min缓慢颠倒混匀数次;
  5. 10,000 × g离心10 min,取上清液至新的2 ml Ep管中,一般转移900 μl,再加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇 (25:24:1)溶液,小心混匀至乳浊状,即一般振荡管子混匀3 min左右,4 °C条件下16,000 × g离心25 min;
  6. 小心吸取上层水相至新的2 ml离心管中,记录体积,加入0.6体积的异丙醇,再加入0.2体积的3 M pH = 5.2醋酸钠 (终浓度为0.3 M),颠倒混匀,放入4 °C过夜,一般6~9小时;
  7. 将沉淀过夜的离心管16,000 × g离心30 min,小心吸掉上清液,注意不要碰到沉淀;
  8. 小心加入70 %的冰乙醇,缓慢加入,小心晃动离心管洗涤沉淀,4 °C条件下16,000 × g离心30 min,小心吸取并弃掉上清液,不要碰到沉淀;
  9. 重复步骤8一次或者两次 (可选步骤);
  10. 在超净台中打开离心管盖,室温下干燥20~30 min,注意不要干燥太久,致使DNA很难洗脱和溶解;
  11. 用适量的去离子水或者1× TE溶液溶解DNA,保存在-80 °C。
  12. 如果第一次提取的DNA浓度达不到后续实验要求,可以进行二次提取,再将装有沉积物的小管加入600-700 μl提取缓冲液,用力将离心后的沉积物弹起,并且混匀,这一步可以参照步骤2,沉积物和缓冲液混合均匀后,放在破碎仪上40 Hz,打碎30 s,打碎三次,每次间歇120 s,加入70 μl 20 % SDS,20 μl蛋白酶K (起始浓度20 mg/ml),65 °C水浴2 h,每30 min混匀一次;
  13. 重复步骤5-11,将两次提取的DNA混合;
  14. 按照步骤6-11重新沉淀和纯化DNA;
  15. 将浓缩纯化后的DNA分装,并保存在-80 °C。


二、 岩石样品 (Zhang et al, 2016)

  1. 实验中要用的铁勺、研钵和玻璃器皿需要用去离子水冲洗2-3次,用铝箔纸包好,在烘箱中烘干,然后放入马弗炉160 °C高温灭菌6小时,待温度降至室温后使用;
  2. 主要使用DNeasy® PowerSoil® Kit提取DNA,对其中有些步骤进行优化。在加入60 μl C1溶液后,向管中加入5 μg用UV照射处理过的Poly (dI-dC) (Sigma-Aldrich,USA),取0.5 g研磨粉碎的岩石样品,在组织研磨机中破碎30 s,频率为70 Hz,打碎三次,每次间歇120 s;
  3. 在室温下,10,000 × g离心1 min,小心将500 μl上清转移至新的2 ml离心管中;
  4. 加入250 μl C2溶液,震荡5 s,4 °C孵育5 min;
  5. 在室温下,10,000 × g离心1 min,小心将600 μl上清转移至新的2 ml离心管中;
  6. 加入200 μl C3溶液,震荡5 s,4 °C孵育5 min;
  7. 在室温下,10,000 × g离心1 min,小心将750 μl上清转移至新的2 ml离心管中;
  8. 使用前将C4溶液混合均匀,加入大约1,200 μl C4溶液,震荡5 s;
  9. 吸取675 μl混合液转移至MB Spin Column中,在室温条件下,10,000 × g离心1 min;将过滤后的液体丢弃。重复此步骤,直至混合液体全部过滤完;
  10. 加入500 μl C5溶液,室温下10,000 × g离心1 min,将过滤后的液体丢弃;
  11. 继续在室温条件下,10,000 × g离心1 min;
  12. 将spin filter转移至新的2 ml离心管中,转移过程中要小心,不要沾到C5溶液;
  13. 向spin filter的膜中心中加入50-60 μl C6溶液,放置在室温2~5 min,然后10,000 × g离心1 min;
  14. 丢弃spin filter,将2 ml离心管中的DNA溶液分装,并保存在-80 °C。
    注:C1-C6溶液为DNeasy® PowerSoil® Kit中试剂。C1溶液有助于细胞裂解的试剂组分;C2和C3溶液的作用是去除样本中的有机物 (腐殖质、细胞碎片、蛋白等);C4溶液是高浓度盐溶液,调整DNA溶液中盐离子浓度,使得DNA可以和MB Spin Column的硅胶柱紧密结合;C5溶液中主要成分为乙醇,可以将盐离子和腐殖酸等物质从MB Spin Column的硅胶柱上洗脱掉;C6溶液为无DNA、低浓度TE缓冲溶液,主要作用是将DNA从MB Spin Column的硅胶柱上洗脱下来,溶解DNA。

溶液配方

一、 DNA抽提缓冲液 (1 L)

  1. 1 M NaH2PO4
    12 g NaH2PO4,用去离子水定容至100 ml,0.22 μm滤膜过滤
  2. 1 M Na2HPO4
    14.2 g Na2HPO4,用去离子水定容至100 ml,0.22 μm滤膜过滤
  3. 0.5 M EDTA (pH 8.0)
    9.3 g EDTA (二水合乙二胺四乙酸二钠) 加50 ml去离子水 (加热和少量NaOH溶解),之后使用NaOH调节溶液pH至8.0
  4. 1 M Tris-HCl (pH 8.0)
    6.1 g Tris-base,加入50 ml水,加入HCl调节pH至8.0
  5. 5 M NaCl
    146.1 g NaCl,用去离子水定容至500 ml
  6. 10 % CTAB
    10 g CTAB用去离子水定容至100 ml
  7. DNA提取缓冲液成分
    200 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0),100 ml 1 M Tris-HCl (pH 8.0),300 ml 5 M NaCl,100 ml 10 % CTAB,用0.22 μm过滤,然后121 °C高压灭菌20 min,待溶液降至50 °C左右,加入6.8 ml 1 M NaH2PO4和93.2 ml 1 M Na2HPO4,用无菌去离子水定容至1 L。(各试剂的终浓度: 0.1 M NaH2PO4, 0.1 M Na2HPO4, 0.1 M EDTA, 0.1 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl, 1 % CTAB)


二、 20 % SDS (十二烷基磺酸钠)
20 g SDS (十二烷基硫酸钠) 用去离子水定容至100 ml (可能需要加热促进溶解)

三、 3 M醋酸钠 (pH 5.2)
12.3 g醋酸钠加入40 ml去离子水,加入醋酸 (大约10 ml) 调节pH至5.2,用0.22 μm滤膜过滤,保存在4 °C

四、 0.5 μg/μl Poly (dI-dC)
称取500 μg Poly (dI-dC),加入到1 ml无菌去离子水中混合均匀,放置在紫外交联仪 (Stratalinker 1800 UV;紫外光功率密度为5000 μJ·cm-2)中处理5-10 min,然后保存在-20 °C (Barton et al, 2006)

注意事项

  1. 用70 %乙醇洗DNA时,要小心加入或者吸取乙醇溶液,切勿使DNA沉淀脱离离心管壁造成DNA损失。
  2. 运用DNeasy® PowerSoil® Kit提取DNA时,MB Spin Column离心后不要接触到C5溶液,C5溶液中含有乙醇。如果最后的DNA洗脱液中含有C5溶液,会影响DNA的后续实验操作。

致谢

沉积物样品中DNA提取实验方案改编自Natarajan Vengadesh Perumal博士发表的论文《A Modified SDS-Based DNA Extraction Method for High Quality Environmental DNA from Seafloor Environments》,岩石样品中DNA的提取方法改编自张新旭博士发表的论文《Diversity and Metabolic Potentials of Subsurface Crustal Microorganisms from the Western Flank of the Mid-Atlantic Ridge》,在此致谢Natarajan Vengadesh Perumal博士和张新旭博士。

参考文献

  1. Barton, H. A., Taylor, N. M., Lubbers, B. R. and Pemberton, A. C. (2006). DNA extraction from low-biomass carbonate rock: an improved method with reduced contamination and the low-biomass contaminant database. J Microbiol Methods 66(1): 21-31.
  2. Natarajan, V. P., Zhang, X., Morono, Y., Inagaki, F. and Wang, F. (2016). A Modified SDS-Based DNA Extraction Method for High Quality Environmental DNA from Seafloor Environments. Front Microbiol 7: 986.
  3. Zhang, X., Feng, X. and Wang, F. (2016). Diversity and Metabolic Potentials of Subsurface Crustal Microorganisms from the Western Flank of the Mid-Atlantic Ridge. Front Microbiol 7: 363.
  4. Zhou, J., Bruns, M. A. and Tiedje, J. M. (1996). DNA recovery from soils of diverse composition. Appl Environ Microbiol 62(2): 316-322.
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Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:牛明杨, 隋维康, 王风平. (2021). 沉积物、岩石样品总DNA提取. Bio-101: e2003375. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003375.
How to cite: Niu, M. Y., Sui, W. K. and Wang, F. P. (2021). Total DNA Extraction from Sediment and Rock Samples. Bio-101: e2003375. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003375.
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