白酒酒醅非破坏性连续采集与核酸提取
Non-destructive Continuous Collection and Nucleic Acid Extraction of Baijiu Fermented Grains   

材料与试剂

1. 枪头 (碧云天Beyotime, catalog numbers: FTIP010, FTIP200, FTIP01C)
2. 离心管 (Nest/耐思, catalog numbers: 602052, 620011, 615001)
3. Parafilm封口膜 (Parafilm, catalog number: PM996)
4. 玻璃珠 (425-600 μm) (Solarbio/索莱宝, catalog number: G8080-100g)
5. 10% SDS Solution (Macklin/麦克林, catalog number: D885207-250 ml)
6. NaH₂PO₄ (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
7. Na₂HPO₄ (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
8. NaCl (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
9. Tris-HCl (pH 8.0) (Macklin/麦克林, catalog number: D885212-250 ml)
10. 三水合乙酸钠 (Macklin/麦克林, catalog number: S817983-500 g)
11. Tris饱和酚 (pH > 7.8) (上海源叶, catalog number: R21022-100 ml)
12. 氯仿 (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
13. 异戊醇 (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
14. 无水乙醇 (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
15. RNase A (Solarbio/索莱宝, catalog number: R8021-25)
16. DEPC水 (上海源叶, catalog number: S30710-500 ml)
17. 琼脂糖 (BIOWEST, catalog number: 111860)
18. 0.1 mol·L^-1 PBS缓冲液 (见溶液配方)
19. Buffer Z缓冲液 (见溶液配方)
20. 3 mol·L^-1 NaAc 溶液 (pH 5.2) (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 移液枪 (Eppendorf/艾本德, catalog number: 3120000267 3120000305 3120000224)
2. 离心机 (Eppendorf/艾本德, model: 5804)
3. 制冰机 (斯科茨曼, model: AF103AS)
4. 超低温冰箱 (THERMO/赛默飞, model: ULTS1490)
5. BeadBeater珠磨式研磨器 (Biospec, catalog number: 3110BXEUR)
6. 电泳仪 (Bio-Rad/伯乐, catalog number: 164-5050)
7. 凝胶成像仪 (MIULAB/米欧仪器, catalog number: GIS-500)
8. NanoDrop 8000分光光度计 (THERMO/赛默飞, catalog number: YQ1633128264)
   

实验步骤

一、酒醅样品非破坏性连续采集

1. 以浓香型白酒窖池为例，分别采集面糟、粮糟、底糟、双轮底糟四个不同空间位置的糟醅。为消除窖池不同位置酒醅的异质性，每个位置取对角线位置的三个样品为对照，取样点示意图如图1。
   
   
   图1. 窖池酒醅样品采集示意图
   1-3为面糟，4-6为粮糟，7-9为底糟，10-12为双轮底糟。
   
   
2. 为了不破坏窖池发酵状态，采用专用取样器进行酒醅样品的采集，取样后用窖泥封好取样孔。取样器参考专利 [申请 (专利) 号：CN202010326489.7] 进行制作，如图2。
   
   
   图2. 白酒酒醅取样器
   
   
3. 以浓香型白酒发酵过程为例，发酵0、2、4、6、8、10、15、20、25、30、40、50、60天取样，每个点取50 g样品。
   
   

二、样品预处理

1. 称取7 g样品，用15 ml灭菌后的 0.1 mol·L^-1 PBS缓冲液悬浮，加入三颗直径5-6 mm玻璃珠，漩涡振荡5 min。
2. 300 × g离心5 min，取上清，沉淀用PBS缓冲液重复洗涤3次，300 × g离心5 min后收集上清。
3. 全部上清于9,000 × g离心3 min，弃去上清，收集细胞沉淀。
4. 沉淀再用5 ml PBS 洗3次，每次于 9,000 × g离心3 min收集沉淀。
5. 沉淀重新悬浮于2 ml PBS溶液中，-20 °C保存。
   
   

三、DNA的提取

1. 取预处理后的样品，于9,000 × g离心5 min，收集沉淀；重新悬浮于1 ml buffer Z 溶液。
2. 混匀后，转移到加有0.3 g玻璃珠 (425-600 μm) 的螺帽管中，加入150 μl苯酚，beadbeater细胞破碎仪以最大速度 (3,000 × g) 击打4 min (每击打80 s，将螺帽管置于冰浴 1 min，共击打三次)。
   注：此步骤注意戴手套操作，防止苯酚伤害皮肤。此步骤后所有操作要轻柔，以防DNA链断裂。
3. 击打后加入110 μl 10% SDS，轻轻颠倒混匀后，冰浴10 min，每5 min轻轻颠倒摇匀。
4. 加入150 μl氯仿:异戊醇 (24:1) 溶液，轻轻混匀，于10,000 × g离心10 min，吸取上清 (800 μl)，加入1/10体积的3 mol·L^-1 NaAc。
   注：务必不要吸取中间混浊物。
5. 用等体积的酚、酚:氯仿混合液和氯仿各抽提一次，于10,000 × g离心10 min，吸取上清 (700、600、500 μl)。
6. 加入2倍体积的冰无水乙醇，于-20 °C沉 2 h 以上，10,000 × g离心15 min，弃上清。
7. 沉淀于真空冷冻干燥后溶于30 μl无菌水中，加入20 mg·mL^-1 RNase A 3 μl，37 °C保温15 min；用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组质量及片段长度，核酸浓度测定仪 (NanoDrop 8000 分光光度计) 测定DNA浓度，-20 °C保存，可用作PCR反应及高通量测序的模板。
   

溶液配方

1. 0.1 mol·L^-1 PBS 缓冲液
   分别量取42.3 ml 1 mol·L^-1 NaH₂PO₄和 57.7 ml 1 mol·L^-1 Na₂HPO₄，用去离子水定容至1,000 ml，灭菌后备用
2. Buffer Z缓冲液
   配制成终浓度为150 mmol·L-1 NaCl，10 mmol·L^-1 Tris-HCl (pH 8.0) 的混合溶液，灭菌后备用
3. 3 mol·L^-1 NaAc 溶液 (pH 5.2)
   称取408.1 g NaAc·3H₂O，溶于约800 ml水中，用冰HAc调节pH值至5.2，加水定容至1,000 ml
   

致谢

感谢江南大学酿造微生物与应用酶学研究室的各位老师同学对本实验方法的帮助和改进。本方法改编自博士论文 (王雪山, 2018)，并已在多篇论文应用 (Wang et al., 2017; 2018)。

参考文献

1. 王雪山. (2018). 不同环境清香类型白酒发酵微生物种群结构比较及溯源解析. 博士学位论文. 江南大学.
2. Wang, X., Du, H. and Xu, Y. (2017). Source tracking of prokaryotic communities in fermented grain of Chinese strong-flavor liquor. Int J Food Microbiol 244: 27-35.
3. Wang, X., Du, H., Zhang, Y. and Xu, Y. (2018). Environmental microbiota drives microbial succession and metabolic profiles during Chinese liquor fermentation. Appl Environ Microbiol 84(4): e02369-02317.