玉米根系简化细菌群落的定量与其生物防治效果的评价方法
Quantification of the Composition Dynamics of a Maize Root-associated Simplified Bacterial Community and Evaluation of Its Biological Control Effect   

材料与试剂

一、耗材

1. 一次性培养皿 (VWR, catalog number: 89022-320)
2. 移液枪枪头 (Corning, Axygen^®, catalog number: T1005WBCRS; Biotix, catalog number: M-0200-1RCNS)
3. 封口膜 (VWR, catalog number: 52858-000) (制造商：Bemis, catalog number: PM996)
4. 接种环 (Globe Scientific, catalog number: 130118)
5. 2.0 ml离心管 (康宁，Axygen^®, catalog number: MCT-200-C-S)
6. 1.5 ml离心管 (VWR, catalog number: 20170-038)
7. 50 ml离心管 (Corning, catalog number: 352098)
8. 手术刀片 (Integra LifeSciences, catalog number: 4-110)
9. 玻璃珠 (Propper, catalog number: 03000600)
10. 纸巾 (KCWW, Kimberly-Clark, catalog number: 34155)
11. 96孔板 (Corning, catalog number: 351172)
12. 细胞刮 (VWR, catalog number: 89260-222)
13. 方形平板 (Thermo Fisher Scientific, Nunc, catalog number: 242811)
14. 移液管 (Gilson，型号：P20, P200和P1000, catalog number: F123600，F123601和F123602; Thermo Fisher Scientific，型号：F1-ClipTip^TM, catalog number: 4661140N和4661130N)
    
    

二、植物
玉米 cv. Sugar Buns F1 (se+) (Johnny’s Selected Seeds, catalog number: 267)

三、细菌菌株
嗜麦芽寡养单胞菌 (Stenotrophomonas maltophilia) ZK5342，垂体苍白杆菌 (Ochrobactrum pituitosum) ZK5343，极小短小杆菌 (Curtobacterium pusillum) ZK5344，路德维希肠杆菌 (Enterobacter ludwigii) ZK5345，产吲哚金黄杆菌 (Chryseobacterium indologenes) ZK5346，弗里辛恩斯草螺菌 (Herbaspirillum frisingense) ZK5347与恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida) ZK5348 (Niu et al., 2017; Niu and Kolter, 2017)。

四、真菌菌株
轮枝镰刀菌 (Fusarium verticillioides) MRC826 (Hinton and Bacon, 1995)

五、化学试剂

1. 乙醇 (Decon Labs, catalog number: V1001)
2. 次氯酸钠溶液 (Janitorial Supplies, Clorox^® 95, catalog number: CLO30966CT)
3. Bacto^TM胰蛋白胨大豆肉汤培养基 (不含葡萄糖) (BD, catalog number: 286220)
4. 大豆酪蛋白消化琼脂 (HiMedia Laboratories, catalog number: GM290-500G)
5. 琼脂 (BD, catalog number: 214010)
6. 10× 磷酸盐缓冲盐 (PBS) (Lonza, catalog number: 17-517Q)
7. Murashige和Skoog基础盐混合物 (MS) (Sigma-Aldrich, catalog number: M5524-50L)
8. 萘啶酸 (Sigma-Aldrich, catalog number: N8878-5G)
9. 粘菌素 (Sigma-Aldrich, catalog number: C4461-100MG)
10. 林可霉素 (Sigma-Aldrich, catalog number: 62143-1G)
11. 金霉素 (Solarbio, catalog number: C4881-5G)
12. 红霉素 (Sigma-Aldrich, catalog number: E5389-1G)
13. 万古霉素 (Sigma-Aldrich, catalog number: 75423-5VL)
14. 氯化钠 (VWR, catalog number: BDH9286-500G)
15. 新生霉素 (Sigma-Aldrich, catalog number: N1628-1G)
16. 妥布霉素 (Sigma-Aldrich, catalog number: T4014-100MG)
17. 葡萄糖 (VWR, catalog number: BDH9230-500G)
18. 胰蛋白胨大豆琼脂培养基 (见溶液配方)
19. 0.1× 胰蛋白胨大豆琼脂培养基 (见溶液配方)
20. 胰蛋白胨大豆肉汤培养基 (见溶液配方)
21. 1× 磷酸盐缓冲液 (PBS) (见溶液配方)
22. ½ MurAshige和Skoog (MS) 琼脂培养基 (见溶液配方)
23. S. maltophilia ZK5342选择培养基 (见溶液配方)
24. O. pituitosum ZK5343的选择培养基 (见溶液配方)
25. C. pusillum ZK5344选择培养基 (见溶液配方)
26. E. ludwigii ZK5345选择培养基 (见溶液配方)
27. C. indologenes ZK5346选择培养基 (见溶液配方)
28. H. frisingense ZK5347选择培养基 (见溶液配方)
29. P. putida ZK5348选择培养基 (见溶液配方)
30. 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (见溶液配方)
31. 水琼脂培养基 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 镊子
2. 二级生物安全柜 (Thermo Fisher Scientific，型号：Herasafe^TMKS9)
3. 离心机 (Eppendorf，型号：5424)
4. 涡旋混合器 (Scientific Industries，型号：Vortex-genie2, catalog number: G560)
5. 分光光度计 (Beckman Coulter，型号：DU 640)
6. 超声波细胞破碎仪 (Qsonica，型号：Q125, catalog number: Q125-110)
7. 天平 (Mettler-Toledo International, catalog number: AG135)
8. 细胞计数板 (Hausser Scientific, catalog number: 1492)
9. 显微镜 (ZEISS，型号：Axioscop 2 plus)
10. 体视显微镜 (ZEISS，型号：Stemi SV 6)
    

软件和数据库

1. RStudio (version 0.99.903)
2. QIIME (version 1.6.0)
3. PRISM (version 6.0c)
   

实验步骤

一、玉米种子的表面灭菌与萌发

1. 挑选10粒健康的完整玉米种子，用镊子放在培养皿 (直径9 cm) 中 (图1. A)。
2. 用70% (v/v) 的酒精浸泡种子3 min，然后倒掉酒精。
3. 用5% (有效氯含量，v/v) 的次氯酸钠溶液浸泡种子3 min，然后倒掉次氯酸钠溶液。
4. 用无菌蒸馏水冲洗种子3次。
5. 吸取第三次冲洗液250 µl，涂布于胰蛋白胨大豆琼脂 (TSA) 平板上，检查种子是否污染。
6. 将TSA平板置于30 °C过夜培养。
7. 若TSA平板上未长出微生物菌落，则继续进行后续步骤，否则，丢弃玉米种子，并重复步骤1至6，直到TSA平板没有菌落长出。
8. 除去培养皿中最后一次清洗玉米种子的蒸馏水。
9. 胚朝上放置玉米种子，并向培养皿中加入7 ml无菌蒸馏水 (图1. B)。
10. 将装有种子的培养皿放置于30 °C的黑暗环境中。
11. 培养24 h后，从培养皿中吸取出250 µl水，并涂布到TSA平板上，以检查种子是否污染。
12. 将TSA平板置于30 °C过夜培养。
13. 若TSA平板上未长出微生物菌落，则继续进行后续步骤，否则，丢弃玉米种子，并重复步骤1至12，直到TSA平板没有菌落长出。
14. 除去培养皿中的水，并补充7 ml无菌蒸馏水。
15. 将培养皿放回30 °C黑暗环境中继续培养。
16. 总共培养50至55 h后，选择已发芽的且根长为1-2 cm的玉米种子 (图1. C)，进行后续步骤。
    

注：在生物安全柜中进行步骤2至16。

二、接种细菌群落至玉米幼苗

1. 将7株细菌 (S. maltophilia ZK5342、O. pituitosum ZK5343、C. pusillum ZK5344、E. ludwigii ZK5345、C. indologenes ZK5346、H. frisingense ZK5347和P. putida ZK5348) 划线接种于0.1× TSA平板上，30 °C培养24-48 h。
2. 挑取每个菌株的单菌落，并接种于5 ml胰蛋白胨大豆肉汤培养基 (TSB) 中，30 °C, 120 rpm过夜摇培。
3. 吸取每个菌株的过夜培养液50 µl，并转接至5 ml新鲜的TSB培养基中，于30 °C摇培8 h。
4. 4 °C, 2,940 × g，离心10 min，收集菌体至2 ml离心管中。
5. 将收集的菌体悬浮于1× 磷酸盐缓冲液 (PBS) 中，并将各菌株的悬浮液稀释至每毫升10⁸个菌体 (表1)。
   
   表1. 各菌株10⁸个菌体/ml的悬浮液对应的的OD₆₀₀值
   
   
   
6. 将各菌株的悬浮液等体积混合于50 ml离心管中，制备多菌株悬浮液 (表2)。
   
    表2. 多菌株悬浮液的菌株组成
   
    注：依次去除7株细菌，将剩余的6株细菌等比例混合，制备6菌株悬浮液。“√”表示多菌株悬浮液中包含该菌株，“×”表示多菌株悬浮液中不包含该菌株。
   
   
7. 室温下，将制备好的多菌株悬浮液倒入培养皿 (直径9 cm) 中，并将不超过30粒经表面灭菌且萌发的玉米种子 (初生根长度为1-2 cm) 浸泡于菌悬液中 (图1. D)，静置0.5-1 h。
8. 拨动种子，确保初生根完全浸没于菌悬液中。将另外10粒表面灭菌且萌发的玉米种子浸泡于1× PBS缓冲液中0.5-1.0 h，作为对照。
9. 用无菌镊子将接种细菌的玉米种子和无菌种子分别转移至盛有20 ml ½ Murashige and Skoog (MS) 琼脂 (0.8%) 培养基的玻璃试管 (16 x 150 mm) 中，并用无菌镊子轻轻按压种子，将玉米的初生根插入培养基中 (图1. E)。用同样口径的无菌空玻璃试管将装有玉米种子的试管封闭，使用封口膜将两只试管口对口连接并固定 (图2. A)。
   
   
    图1. 玉米种子。A. 干种子；B. 表面灭菌后的种子；C. 表面灭菌且萌发的种子；D. 浸泡在多菌株悬浮液中的表面灭菌且萌发的种子；E. 在½ Murashige and Skoog琼脂培养基中放置的种子。比例尺= 1 cm。
   
   
   图2. 玉米无菌苗的生长。A. 双试管生长室。用封口膜将两个玻璃试管口对口连接并固定。B. 在双试管生长室中生长的不同苗龄的无菌玉米苗。
   
   
10. 将玉米幼苗置于25 °C，相对湿度54%，光照16 h／黑暗8 h, 4,000 lx 的条件下连续培养15天。
    

注：在生物安全柜中或靠近火焰处进行步骤1至9。

三、玉米根系细菌群落组成的定量

1. 在接种细菌群落后的第5天、第10天和第15天，从接种不同群落的处理中分别选取3-5株玉米幼苗样品。
2. 使用无菌手术刀片 (视频1) 切下玉米幼苗的根系。
   
   
   
   视频1. 玉米幼苗根系样品的采集
   
   
3. 使用无菌1× PBS缓冲液快速冲洗根系样品，去除附着在根表面的琼脂。
4. 使用无菌手术刀片切取近籽粒的1 cm长的初生根片段。
5. 使用无菌手术刀片切除根段上的侧根。
6. 使用两个无菌的200 µl枪头将根段转移至1.5 ml离心管中。
7. 将6个玻璃珠 (直径：3 mm) 放入离心管中，并加入1 ml无菌1× PBS缓冲液。
8. 超声波震荡1 min (振幅：30%；脉冲：01 s，01 s；时间：30 s)，洗脱定殖于根表面的细菌，然后涡旋震荡1 min。
9. 重复步骤8两次后，将离心管在冰上放置1 min。
10. 向96孔细胞培养板的1列，8个孔中，分别加入180 µl无菌1× PBS缓冲液 (视频2)。
    
    
    
    视频2. 细菌悬浮液的稀释与涂板
    
    
11. 吸取步骤9中获得的细菌悬浮液20 µl，加入第一个孔内，使用移液器反复吸吐混匀。
12. 使用镊子将根段取出，并用吸水纸擦干后，在天平上称重，记录根段的质量。
13. 依次将20 µl细菌悬浮液从第一个孔转移至第八个孔内，使用移液器反复吸吐混匀后，获得10至10⁸倍菌悬液稀释液。
14. 使用排枪从每个孔中吸取10 µl菌悬液，滴加在0.1× TSA选择性平板 (表3) 上，倾斜平板，使菌悬液朝一个方向移动，将菌体分散在平板表面。
    
    表3. 选择培养基的添加物与各菌株的培养时间
    
    
    
15. 每个样品重复3次。
16. 于生物安全柜中，将接种了细菌的选择性0.1× TSA平板晾干。
17. 在30 °C、黑暗条件下，培养16至60 h (表3)。
18. 统计并记录选择性平板上菌落形成单位 (CFU) 的数量 (图3. A)。
19. 使用10到200之间的CFU数值 (图3. B) 计算细菌含菌量：
    
    
    
    图3. 模式细菌群落中各菌株的菌落。A. 生长在普通与选择性0.1× TSA平板上的7个细菌菌株的菌落形态。“P”和“S”分别代表普通0.1× TSA平板与选择性0.1× TSA平板。B. 在选择性0.1× TSA平板上生长的垂体苍白杆菌。从左到右，依次接种10⁴、10³、10²与10倍菌悬液稀释后长出的细菌菌落。方框标记区域的CFU (菌落形成单位) 数量适用于细菌的定量。
    
    
20. 计算群落中各菌株的相对含量。
    20.1

    在生物安全柜中或靠近火焰处进行步骤2至16。
    20.2

    观看视频1，了解步骤2至7的详细信息。
    20.3

    观看视频2，了解步骤10至16的详细信息。
    
    

四、模式细菌群落防治玉米苗枯病效果的检测
注：在超净工作台内或靠近火焰处进行步骤1至10。

1. 将直径为0.5 cm的轮枝镰刀菌 (Fusarium verticillioides) MRC826的菌饼置于马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) 平板的中心，于28 °C培养7天，直到菌丝覆盖整个平板。
2. 将20 ml的无菌1× PBS缓冲液加入生长于PDA平板上的轮枝镰刀菌菌落中。
3. 使用细胞刮刀收获新鲜的真菌孢子。
4. 采用八层无菌纱布过滤真菌孢子悬浮液。
5. 稀释孢子悬浮液，并在显微镜下使用血球计数器对孢子进行计数。
6. 使用0.01% (vol/vol) 的无菌吐温20将悬浮液的浓度调整至每毫升约10⁸个孢子，并储存于4 °C。
7. 使用无菌1× PBS缓冲液稀释悬浮液至每毫升约10⁶个孢子。
8. 将真菌孢子涂布于20 ml 2.25% (wt/vol) 的水琼脂平板上 (~10³ CFU/cm²)。
9. 将10粒经表面灭菌的玉米种子 (图1. B) 分别置于30 ml 7菌株悬浮液、各单一菌株悬浮液、或者大肠杆菌DH5α悬浮液中，浸泡0.5至1.0 h。另外，将10粒经表面灭菌的种子浸泡于30 ml的无菌1× PBS中0.5至1.0 h，作为对照。
10. 用无菌镊子将玉米种子放在水琼脂平板上。
11. 将平板置于23 °C、黑暗条件下10天。
12. 每天统计并记录各处理中表面可观察到真菌菌丝的种子数 (图4. A)，根据以下公式计算真菌定殖率：
    
    
13. 分别在接种后的第4天与第10天，使用体视显微镜拍摄每粒种子表面的真菌菌丝 (图4. B)。
    
    
    图4. 接种模式细菌群落与轮枝镰刀菌的玉米幼苗。A. 在涂布真菌孢子的水琼脂上生长10天的接种细菌群落的玉米幼苗。琼脂上的白色斑点是由真菌孢子发育而成的真菌菌落。B. 放大的玉米种子，如黄色虚线所示。白色毛状物是定殖于种子表面的真菌菌丝 (比例尺= 2 mm)。
    
    
14. 接种后第10天，调查各处理中玉米苗枯病的严重程度，参考前期研究中确定的病害等级 (Niu et al., 2017)，根据公式 (Sherwood and Hagedorn, 1958) 计算病害严重度指数：
    
    病害等级如下：
    0级：籽粒表面无可见真菌菌丝生长，根部无病斑；
    1级：籽粒表面无可见真菌菌丝生长，根部出现棕褐色病斑；
    2级：籽粒表面被真菌菌丝部分覆盖，且根部出现棕褐色病斑；
    3级：籽粒表面被真菌菌丝部分覆盖，且根部出现棕褐色至褐色病斑；
    4级：籽粒表面被真菌菌丝完全覆盖，且根部出现棕褐色至褐色病斑；
    5级：籽粒表面被真菌菌丝完全覆盖，且根部出现棕红色病斑 (Niu et al., 2017)。
    

数据分析

根据每个菌株的相对含量，通过使用RStudio中“Vegan”软件包 (version0.99.903)计算Bray-Curtis (BC) 距离。使用“gplots”中的“hclust”功能，通过层次聚类，生成相异矩阵对应的聚类树状图。采用QIIME (version 1.6.0) 计算接种6菌株混合菌悬液的玉米根表细菌群落与接种7菌株混合菌悬液的根表细菌群落之间的BC距离。采用Fisher’s LSD检验 (PRISM, version6.0c) 进行以下比较：1) 每株植物的6菌株群落与7菌株群落之间的BC距离。2) 单独采用F. verticillioides处理，F. verticillioides与模式细菌群落共同处理，F. verticillioides分别与各菌株共同处理，以及F. verticillioides与大肠杆菌DH5α共同处理的玉米幼苗的真菌定殖率与病害严重度指数。

溶液配方

1. 胰蛋白胨大豆琼脂培养基
   20 g胰蛋白胨大豆琼脂 (HiMedia Laboratories)
   1,000 ml蒸馏水
   121 °C高压灭菌20 min
2. 0.1× 胰蛋白胨大豆琼脂培养基
   1.38 g胰蛋白胨大豆肉汤 (不含葡萄糖) (BD)
   7.5 g琼脂 (BD)
   500 ml蒸馏水
   121 °C高压灭菌20 min
3. 胰蛋白胨大豆肉汤培养基
   13.75 g胰蛋白胨大豆肉汤 (不含葡萄糖) (BD)
   1,000 ml蒸馏水
   121 °C高压灭菌20 min
4. 1× 磷酸盐缓冲液 (PBS)
   100 ml不含钙或镁的PBS (10×) (Lonza)
   900 ml蒸馏水
   121 °C高压灭菌20 min
5. ½ MurAshige和Skoog (MS) 琼脂培养基
   2.15 g Murashige和Skoog基础盐混合物 (Sigma-Aldrich)
   4 g琼脂 (BD)
   500 ml蒸馏水
   121 °C高压灭菌20 min
6. S. maltophilia ZK5342选择培养基
   1.38 g胰蛋白胨大豆肉汤 (不含葡萄糖) (BD)
   7.5 g琼脂 (BD)
   500 ml蒸馏水
   121 °C高压灭菌20 min
   将灭菌后的培养基冷却至60 °C，加入300 µl新生霉素 (Sigma-Aldrich) (100 mg/ml)和12.8 µl妥布霉素 (Sigma-Aldrich) (39.1 mg/ ml)
7. O. pituitosum ZK5343的选择培养基
   1.38 g胰蛋白胨大豆肉汤 (不含葡萄糖) (BD)
   7.5 g琼脂 (BD)
   500 ml蒸馏水
   121 °C高压灭菌20 min
   将灭菌后的培养基冷却至60 °C，加入200 µl粘菌素 (Sigma-Aldrich) (10 mg/ml)，125 µl红霉素 (Sigma-Aldrich) (20 mg/ml) 和70 µl万古霉素 (Sigma-Aldrich) (100 mg/ml)
8. C. pusillum ZK5344选择培养基
   1.38 g胰蛋白胨大豆肉汤 (不含葡萄糖) (BD)
   7.5 g琼脂 (BD)
   500 ml蒸馏水
   121 °C高压灭菌20 min
   将灭菌后的培养基冷却至60 °C，加入1,132 µl萘啶酸 (Sigma- Aldrich) (5 mg/ml)，226.4 µl粘菌素 (Sigma-Aldrich) (10 mg/ml) 和66 ml NaCl (VWR International) (30%, wt/vol)
9. E. ludwigii ZK5345选择培养基
   1.38 g胰蛋白胨大豆肉汤 (不含葡萄糖) (BD)
   7.5 g琼脂 (BD)
   500 ml蒸馏水
   121 °C高压灭菌20 min
   将灭菌后的培养基冷却至60 °C，加入163.77 µl红霉素 (Sigma-Aldrich) (20 mg/ml)和155.07 ml NaCl (VWR International) (30%, wt/vol)
10. C. indologenes ZK5346选择培养基
    1.38 g胰蛋白胨大豆肉汤 (不含葡萄糖) (BD)
    7.5 g琼脂 (BD)
    500 ml蒸馏水
    121 °C高压灭菌20 min
    将灭菌后的培养基冷却到60 °C，加入650 µl金霉素 (Solarbio) (10 mg/ml)、400 µl粘菌素 (Sigma-Aldrich) (10 mg/ml) 和250 µl 萘啶酸 (Sigma-Aldrich) (5 mg/ml)
11. H. frisingense ZK5347选择培养基
    1.38 g胰蛋白胨大豆肉汤 (不含葡萄糖) (BD)
    7.5 g琼脂 (BD)
    500 ml蒸馏水
    121 °C高压灭菌20 min
    将灭菌后的培养基冷却至60 °C，加入1,000 µl萘啶酸 (Sigma-Aldrich) (5 mg/ml), 200 µl粘菌素 (SigmA-Aldrich) (10 mg/ml) 和1,000 µl林可霉素 (Sigma-Aldrich) (50 mg/ml)
12. P. putida ZK5348选择培养基
    1.38 g胰蛋白胨大豆肉汤 (不含葡萄糖) (BD)
    7.5 g琼脂 (BD)
    500 ml蒸馏水
    121 °C高压灭菌20 min
    将灭菌后的培养基冷却到60 °C左右后，加入500 µl萘啶酸 (Sigma-Aldrich) (5 mg/ml) 和125 µl红霉素 (Sigma-Aldrich) (20 mg/ml)
13. 马铃薯葡萄糖琼脂培养基
    200 g马铃薯提取物
    17 g琼脂 (BD)
    20 g葡萄糖 (VWR International)
    1,000 ml蒸馏水
    115 °C高压灭菌20 min
14. 水琼脂培养基
    11.25 g琼脂 (BD)
    500 ml蒸馏水
    121 °C高压灭菌20 min
    

致谢

感谢Charles Bacon博士馈赠轮枝镰刀菌菌株 (Fusarium verticillioides)。感谢Kolter实验室成员提供的宝贵建议。本项工作得到了国家自然科学基金 (31801785)、黑龙江省自然科学基金 (YQ2019C002)、美国卫生部项目 (GM58213)、中央高校基本科研业务费专项资金项目 (2572018BD05) 与东北林业大学引进人才科研启动经费项目 (JQ2017-02) 的资助。本实验流程基于已发表的论文 (Niu and Kolter, 2017; Niu et al., 2017) 撰写。

参考文献

1. Hinton, D. M. and Bacon, C. W. (1995). Enterobacter cloacae is an endophytic symbiont of corn. Mycopathologia 129(2): 117-125. 
2. Niu, B. and Kolter, R. (2017). Complete genome sequences of seven strains somposing a model cacterial community of maize roots. Genome Announc 5(36).
3. Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X. and Kolter, R. (2017). Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proc Natl Acad Sci U S A 114(12): E2450-E2459.
4. Sherwood, R. and Hagedorn, D. J. (1958). Determining common root rot rotential of rea fields. Agricultural Experiment Station, University of Wisconsin, Madison, WI.