水禽粪便微生物移植技术
Protocol for Fecal Microbiota Transplantation in Waterfowl   

研究背景

肠道微生物是联结宿主营养、代谢和免疫系统的纽带。随着宏基因组学和培养组学的发展，疾病与肠道微生物的联系；菌株的定殖对宿主的影响正不断地得到揭示。FMT技术作为一种研究肠道菌群的新兴技术手段也在蓬勃发展，对肠易激综合征、炎症性肠病、胰岛素抵抗和多发性硬化症等疾病FMT都表现出良好的疗效。对于禽类来说，微生物群在机体代谢功能和免疫功能中都起着独特的作用。随着宏基因组学和培养组学的发展，以及禽类肠道微生物数据库的建立，FMT在水禽产业中以及动物模型中的应用将会越来越广泛，通过对水禽 FMT 技术的标准化，在无抗养殖的大环境下改善水禽的肠道健康，推进整个畜牧行业向绿色养殖过渡将成为可能。
原理
微生物样品经过处理后，通过口服灌胃的方法，由动物口腔直接注入受体动物胃中，使其在肠道定殖，实现肠道微生物移植，从而研究不同微生物对受体动物的功能及作用机制。

材料与试剂

1. 一次性注射器
2. 灌胃塑胶软管
3. NaCl
4. KCl
5. Na₂HPO₄·12H₂O
6. KH₂PO₄
7. 各种型号枪头 (20 μl, 200 μl, 1 ml) 
8. 甘油
9. 液氮
10. 纱布
11. Eppendorf无菌离心管
12. 0.25 mm孔径不锈钢网筛
13. 电子秤
14. PBS (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 高压灭菌锅
2. 离心机
3. -80 °C冰箱
4. 涡旋振荡器
5. 水浴锅
6. 移液器
7. pH计
   

实验步骤

一、样本采集和处理

1. 收集供体鸭新鲜粪便。将收集到的粪便样品保存在无菌的Eppendorf管中，置于冰上，快速转移到实验室 (如需长时间运输，需要置于干冰和液氮中冷冻保存) 。
2. 将收集到的粪便样品转移到实验室后，将其与无菌、非抑菌磷酸盐缓冲液 (PBS) 按照1:5的比例混合稀释，匀浆5 min。
3. 将混匀后的悬浮液通过0.25 mm孔径的不锈钢网筛，重复过滤三次。
4. 将滤液转移到无菌的离心管中，置入离心机中，于1,00 x g转速离心5分钟。
5. 用移液枪小心吸取上清液，置入冻存管中。制作好的粪便菌液可即刻用于受体，进行粪便微生物移植操作 (如需长期保存，则需要在菌液中加入10%无菌甘油，混合完全后置于-80 °C环境保存，冷冻样品需在6个月内使用完毕) 。使用冻存菌液前，需要在水浴锅中复苏，根据宿主动物直肠温度决定水浴温度（鸭41.0 -42.5℃，鹅40.0-41.3℃）。复苏菌液后，将粪菌液混匀，吸取少量样本用无菌PBS稀释，用酶标仪于600nm波长读数，OD值1对应浓度为2 x 10⁹ CFU，继续稀释菌液绘制标准曲线，每次复苏后测定细菌浓度，确保浓度大于10⁸ CFU。
   
   
   
   视频1.禽类粪便菌液制备

1. 取出受体鸭，称重。根据重量（10 ml/kg）换算灌胃剂量。
2. 按照剂量吸取粪便菌液，将灌胃软管与注射器匹配。
3. 反复吹打几次，排净灌胃管内空气，保证管内充盈菌液。
4. 将受体鸭保定，右手将双翅交叉，左手打开喙部，使其头、颈和身体呈直线。防止动物窒息或位移。
5. 沿着受体鸭食管向腹部左侧进管，注射粪便菌液 (过程要迅速，防止受体鸭产生应激反应或呕吐) 。如遇到明显阻力，应停止灌胃。
6. 松开动物，观察动物反应，如无呼吸异常或呕吐现象，可确定灌胃成功。
   
   
   
   视频2.禽类粪便菌液移植

注意事项

1. 供体鸭表观特征与行为应当符合如下条件：①生长发育良好；②无不良行为 (如啄癖，异食癖) ；③羽毛完整，身体表面无伤口或其他损伤；④体温维持在40-42 °C之间；⑤正常饮水采食；⑥粪便正常，未出现病变样粪便，或者便秘；⑦无使用抗生素或其他药物记录；⑧两周内不能接种弱毒疫苗，不能接触其他有过疫病史的动物。
2. 应及时收集新鲜粪便，并尽快将供体粪便转移至实验室，制作粪便菌液。
3. 制作粪便菌液过程中使用的设备容器都应做灭菌处理。
4. 为避免交叉污染，每次灌胃都需要替换洁净无菌的注射器和禽用灌胃塑胶软管。
   

溶液配方

1. PBS
   称取NaCl: 8 g, KCl: 0.2 g, Na₂HPO₄·12H₂O: 3.628 g, KH₂PO₄: 0.24 g，加入灭菌去离子水定容至1 L，用NaOH或HCl调节pH至7.4
   

致谢

感谢国家自然科学基金面上项目 (32072751) ，广东省现代农业产业技术体系创新团队 (2019KJ137) ，十三五重点研发计划 (2016YFD0500509-07) ，国家水禽产业技术项目 (CARS-42-15) ，广东省基础与应用基础研究基金温氏联合基金项目 (2019B1515210012) 对本研究提供的资助。

参考文献

1. Hamilton, M. J., Weingarden, A. R., Unno, T., Khoruts, A., and Sadowsky, M. J. (2013) High-throughput DNA sequence analysis reveals stable engraftment of gut microbiota following transplantation of previously frozen fecal bacteria. Gut Microbes 4, 125-135.
2. Hu, J., Chen, L., Tang, Y., Xie, C., Xu, B., Shi, M., Zheng, W., Zhou, S., Wang, X., and Liu, L. (2018) Standardized Preparation for Fecal Microbiota Transplantation in Pigs. FRONT MICROBIOL 9, 1328.
3. Li X, Li X, Shang Q, Gao Z, Hao F, Guo H, Guo C. Fecal microbiota transplantation (FMT) could reverse the severity of experimental necrotizing enterocolitis (NEC) via oxidative stress modulation. Free Radic Biol Med. 2017 Jul;108:32-43.
4. Willing, B. P., Anjalee, V., Matthew, C., Teerawat, T., Brett, F. B., and Stefan, B. (2011) Altering Host Resistance to Infections through Microbial Transplantation. PLOS ONE 6, e26988.