口腔常见微生物的培养方法
Culture Method of Oral Common Microorganisms   

材料与试剂

1. 无菌脱纤维羊血（品牌：Solarbio；产地：中国；catalog number: TX0030）
2. 琼脂（品牌：Biotopped；产地：日本；catalog number: A6190）
3. 氯化血红素-维生素K1（品牌：PYG；产地：日本；catalog number: 21301）
4. 脑心浸液肉汤培养基（BHI）（品牌：Oxiod；产地：美国；catalog number: CM1135）
5. 脑心浸液琼脂培养基（品牌：AOBOX；产地：中国；catalog number: 02-349）
6. MRS肉汤培养基（品牌：Oxiod；产地：美国；catalog number: CM0359B）
7. MRS琼脂培养基（品牌：Oxiod；产地：美国；catalog number: CM0359B）
8. 液体沙氏培养基（品牌：海博；产地：中国；catalog number: HB0379）
9. 沙氏琼脂培养基（品牌：海博；产地：中国；catalog number: HB0235）
   

仪器设备

1. 二氧化碳孵箱（品牌：Thermo Fisher Scientific；产地：美国；catalog number: ab12345）
2. 电热恒温培养箱（品牌：上海一恒；产地：中国；catalog number: DHP-9052）
3. 厌氧培养罐（品牌：尤德生物；产地：中国；catalog number: UT706）
4. 厌氧产气袋（品牌：梅里埃；产地：法国；catalog number: 45534）
5. 恒温摇床（品牌：RADOBIO；产地：中国；catalog number: Stab S2）
6. 立式压力蒸汽灭菌器（品牌：上海申安；产地：中国；catalog number: LDZX-30KBS）
   

实验步骤

一、培养方法

1. 口腔链球菌（Streptococcus），包括血链球菌（Streptococcus sanguinis）、变异链球菌（Streptococcus mutans）、唾液链球菌（Streptococcus salivarius）、酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）、轻型链球菌（Streptococcus mitis）等的培养。
   该方法已被广泛应用于多个研究并得到了有效验证（Fu, 2013; Zhu and Wang, 2017; Sun et al., 2019；Ren et al., 2014）。
   1.1

   培养基的选择：选用脑心浸液肉汤（brain heart infusion, BHI）培养基和BHI琼脂培养基。
   1.2

   菌株的活化与复壮：取20 μl冻存于甘油管中的保种液，接种于1 ml的BHI肉汤培养基中，于5%二氧化碳孵箱（或厌氧培养罐）中，37 ℃下静置培养24 h，活化菌株。将过夜培养的口腔链球菌采用三区划线的方式转接于BHI琼脂培养基上，37 ℃培养48 h，以此连续活化3次。
   1.3

   菌株扩大培养：从培养皿上挑取单菌落，接种到1 ml的BHI肉汤培养基中，放置到5%二氧化碳孵箱中（或厌氧培养罐中），37 ℃下静置培养12 h。
   1.4

   菌种的保存：常采用冷冻保存法或液氮保存法（Zhou et al., 2009）。


2. 口腔乳酸杆菌属（Lactobacillus），包括嗜酸乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus）、干酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei）等的培养。
   该方法已被广泛应用于多个研究并得到了有效验证（Wright and Klaenhammer, 1981；Zhang et al., 2014）。
   2.1

   培养基的选择：通常选用MRS肉汤培养基（De Man, Rogosa and Sharpe Broth）和MRS琼脂培养基（Ratchapin et al., 2016; Zinatizadeh et al., 2018; Lin et al., 2020）。
   2.2

   菌株的活化与复壮：取20 μl冻存于甘油管中的保种液，接种于1 ml的MRS肉汤培养基中，于37 ℃条件下静置培养24 h，活化菌株（Chen et al., 2017; Yue et al., 2020）。将过夜培养的乳酸杆菌采用三区划线的方式转接于MRS琼脂培养基上，37 ℃培养48 h，以此连续活化3次。
   2.3

   菌株扩大培养：从培养皿上挑取单菌落，接种到1 ml的MRS肉汤培养基中，放置到5%二氧化碳孵箱中（或厌氧培养罐中），37 ℃下培养18 h。
   2.4

   菌种的保存：常用的有冷冻保存法或冷冻干燥法。
   
   
3. 常见牙周致病菌的培养
   主要牙周致病菌包括：牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）、具核梭杆菌（Fusobacteria nucleatum）、中间普雷沃菌（Prevotella intermedia）以及伴放线聚集杆菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）等。该方法已被广泛应用于多个研究并得到了有效验证（Moslemi et al., 2015; Lu et al., 2009；Li et al., 2019）。
   3.1

   培养基的选择：通常选用BHI血肉汤培养基和BHI血琼脂平板培养基（用于厌氧菌培养，最好新鲜配置，避免放置时间过长而渗入大量氧气）。
   3.2

   菌种复苏：从吸取20 μl保种液，接种到BHI血琼脂平板培养基上，放入厌氧培养袋中，并将袋置入5%二氧化碳孵箱（厌氧袋法）；也可直接置于含有80%N₂、10%H₂和10%CO₂混合气体的厌氧培养罐中（厌氧培养罐法），37 ℃下培养5-7 d。
   3.3

   菌株扩大培养：从培养皿上挑取1-3个单菌落，接种到2 ml的BHI血肉汤培养基中，放到厌氧产氧袋中，将袋置入37 ℃的空气孵箱中，培养48 h。
   3.4

   菌种的保存：常用的有冷冻保存法或冷冻干燥法。
   注：另外一个重要的牙周致病菌伴放线聚集杆菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）是微需氧菌，生长需要5~10%的二氧化碳条件下，其他操作步骤同上。


4. 口腔白色念珠菌（Candida albicans）的培养
   该方法已被广泛应用于多个研究并得到了有效验证（Khan et al., 2013; Gamarra et al., 2015；Hu et al., 2019）。
   4.1

   培养基的选择：通常选用沙氏（Sabouraud）琼脂培养基和沙氏液体培养基。
   4.2

   菌种复苏：吸取20 μl甘油保种液，接种到沙氏琼脂培养板上，放置到5%二氧化碳孵箱中，37 ℃下培养48 h（Jacouton et al., 2017）。
   4.3

   菌株扩大培养：从培养皿上挑取单菌落，接种到1 ml的沙氏液体培养基中，37 ℃下150 r/min摇瓶培养48 h（Yue et al., 2020）。
   4.4

   菌种的保存：常用的有冷冻保存法或冷冻干燥法。

二、 培养基的配制
注：培养基的配制及灭菌需要参考产品包装上的说明，不同品牌的同一产品配制比例及灭菌温度和时间可能不一样。

1. BHI肉汤培养基：称取3.7 g BHI肉汤干粉，溶于100 ml蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min，待冷却至常温，备用。
2. BHI血肉汤培养基：将3.7 g BHI 肉汤干粉，溶于100 ml蒸馏水中。121 ℃高压灭菌15 min，降至50 ℃。以1:10和1:100的浓度加入无菌脱纤维羊血（冻融的羊血效果更佳）和氯化血红素-维生素K，震荡混合均匀。冷却至常温，放入4 ℃冰箱，避光保存，备用。
3. BHI琼脂培养基：称取5.2 g BHI琼脂干粉，溶于100 ml蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min，待温度降至50℃左右倒入无菌培养皿中，待凝固，备用。
4. BHI血琼脂平板培养基：将BHI粉、琼脂粉与蒸馏水以3.7 g：2 g：100 ml的比例混合。121℃高压灭菌15 min，降至50 ℃。以1:10和1:100的浓度加入无菌脱纤维羊血（冻融的羊血效果更佳）和氯化血红素-维生素K，震荡混合均匀。倾注于无菌平板上，待其冷却凝固，放入4 ℃冰箱，避光保存，备用。
5. MRS肉汤培养基：称取5.2 g MRS肉汤干粉，溶于100 ml蒸馏水中，115 ℃高压灭菌20 min，待冷却至常温，备用。
6. MRS琼脂培养基：称取6.62 g MRS琼脂粉，溶于100 ml蒸馏水中，115 ℃高压灭菌20 min，待温度降至50 ℃左右倒入无菌培养皿中，待凝固，备用。
7. 沙氏液体培养基：称取5 g液体沙氏培养基干粉，溶于100 ml蒸馏水中，115  ℃高压灭菌20 min，待冷却至常温，备用。
8. 沙氏固体培养基：称取6.5 g液体沙氏琼脂培养基干粉，溶于100 ml蒸馏水中，115 ℃高压灭菌20 min，待温度降至50  ℃左右倒入无菌培养皿中，待凝固，备用。

参考文献

1. Fu, H. (2017). Clinical study of oral Candida Albicans infection screening and diagnosis. Chin J Med Guide 000(004): 616-618. (in Chinese)
2. Ren, W., Chen, F., Zhang, Y., Zhang, Q., Wang, X., Liu, Y., Yuan, C., Ma, Q., Xu, T. and Zheng, S. (2014).Identification of Streptococcus mutans in carious patients’ saliva samples by MALDI-TOF mass spectrometry. J Peking Univ Health Sci 46(1): 25-29. (in Chinese)
3. Zhou, X. D., Xiao, L. Y. and Xiao, X. R. (2009). Applied oral microbiology and technique. People's Medical Publishing House Co., LTD. ISBN: 9787117112857. (in Chinese)
4. Zhu, L. F. and Wang, B. (2017). Platycodin D protects oral epithelial cells against infection of Candida albicans. Chin J Pathophys 33(1): 161-165. (in Chinese)
5. Chen, Z. Y., Hsieh, Y. M., Huang, C. C. and Tsai, C. C. (2017). Inhibitory effects of probiotic Lactobacillus on the growth of human colonic carcinoma cell line HT-29. Molecules 22(1): 107.
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8. Khan, M. A., Khan, S. M., Sarker, M., Hussain, R., Ahmed, M., Joarder, Y., and Hasan, M. (2013). Studies on microscopic technique and culture on Sabouraud’s dextrose agar medium for diagnosis of dermatophytes infection. KYAMC Journal, 3(1): 235-238.
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14. Sun, Y., Pan, Y. H., Sun,Y., Li, M. Y., Huang, S. B., Qiu, W., Tu, H. X. and Zhang, K. K. (2019). Effects of norspermidine on dual-species biofilms composed of Streptococcus mutans and Streptococcus sanguinis. Biomed Res Int 3: 1950790.
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17. Yue, Y., Ye, K., Lu, J., Wang, X., Zhang, S., Liu, L., Yang, B., Nassar, K., Xu, X., Pang, X. and Lv, J. P. (2020). Probiotic strain Lactobacillus plantarum YYC-3 prevents colon cancer in mice by regulating the tumour microenvironment. Biomed Pharmacother 127: 110159.
18. Zhang, Y., Liu, Y., Ma, Q., Song, Y., Zhang, Q., Wang, X. and Chen, F. (2014). Identification of Lactobacillus from the saliva of adult patients with caries using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. PLoS One 9: e106185.
19. Zinatizadeh, N., Khalili, F., Fallah, P., Geravand, M. and Yaslianifard, S. (2018). Potential preventive effect of Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus plantarum in patients with polyps or colorectal cancer. Arq Gastroenterol 55(4): 407-411.