摘要: 扩增子和宏基因组测序等方法为筛选临床疾病特异的致病菌 (属、株) 提供了便利,而进一步对已筛选的致病菌进行致病机制的研究也尤其重要。与原位杂交检测致病菌相比,通过荧光对菌株直接进行标记的方法可更灵敏、快速及精确地对菌株进行示踪,该方法可应用于相关动物和细胞模型中单菌定植、移位等致病机制研究。本方案将以E. coli MG1655为例,介绍如何利用EGFP对E. coli菌株进行标记示踪。
关键词: EGFP, 大肠杆菌, 小鼠, 细菌移位
材料与试剂
仪器设备
实验步骤
一、构建E. coli EGFP-MG1655荧光标记大肠杆菌[1]
二、利用E. coli EGFP-MG1655在野生型C57BL/6J小鼠中示踪细菌[2]细菌标记技术是使用标记物标记细菌,以实现对目标细菌的识别,从而对其进行定位和示踪。为了探究E. coli EGFP-E. coli MG1655 是否在小鼠的肠道黏膜上进行 定位,本实验采用肝脏冰冻病理切片观察,对细菌粘附的现象进行检测。为了定位E. coli MG1655,构建了增强型绿色荧光蛋白 (enhanced green fluorescent protein, EGFP) 荧光标记和氨苄青霉素抗性E. coli EGFP-MG1655,并将其应用于动物实验。
结果与分析
使用CV129载体可将EGFP荧光标记基因和氨苄青霉素抗性基因导入E. coli MG1655 (图1A),琼脂糖电泳示EGFP标记的且具有氨苄青霉素抗性的E. coli EGFP-MG1655 构建成功 (图1B),含氨苄青霉素的LB培养基可见E. coli EGFP-MG1655细菌菌落生长 (图1C),下一步该菌可应用于动物实验。图 1. E. coli EGFP-MG1655荧光标记菌株构建。A. EGFP 重组质粒的构建和转 化过程 (上海吉凯基因公司供图);B. E. coli EGFP-MG1655的PCR鉴定;C. E. coli MG1655和E. coli EGFP-MG1655涂板鉴定。用E. coli EGFP-MG1655 灌胃处理C57BL/6J小鼠,小鼠肠道冰冻病理切片均可见明 显的绿色荧光信号,可对E. coli EGFP- MG1655在肠道的粘附进行示踪 (图2)。图2. E. coli EGFP- MG1655可粘附至C57BL/6J小鼠肠道。小鼠肠道冰冻切片中E. coli EGFP-MG1655的检测,可定位于肠道细胞周围 (红色箭头,EGFP 绿色荧光信号),白色刻度线表示20 µm。
失败经验
致谢
本文实验方案所用仪器由北京大学人民医院消化内科实验室和北京大学医学部药学院国家重点实验室提供。资金来源:国家自然科学基金 (81873549) 和北大医学交叉研究种子基金 (BMU2020MX011)。实验方案及部分结果摘自张一帆博士毕业论文。
参考文献
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