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菌酶一体化重组酵母工程菌的设计与构建
Design and Construction of Recombinant Yeast with Surface-displayed Enzymes   

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摘要:酵母细胞表面展示是一种固定化表达异源蛋白的真核展示系统,在文库筛选、生物吸附、免疫检测和生物传感器研发等领域发挥重要作用。外源蛋白通过酿酒酵母a凝集素展示在细胞表面。a凝集素包含核心亚基AGA1及结合亚基AGA2。AGA1与酵母细胞壁β-葡聚糖共价连接,并通过两个二硫键与AGA2的N端共价相连。外源蛋白与AGA2的C端融合,从而实现外源蛋白在酿酒酵母细胞的表面展示。本实验通过AGA1和AGA2将外源蛋白固定在酵母细胞表面,获得菌酶一体化的微生物细胞反应器。

关键词: a凝集素, 外源蛋白, 表面展示, 酿酒酵母

材料与试剂

  1. 盖玻片 (上海生工公司, catalog number: F518117)
  2. 载玻片 (上海生工公司, catalog number: F518110)
  3. FALCON流式上样管 (BD, catalog number: 352003)
  4. 离心管
  5. 各种型号枪头
  6. 酵母提取物 (BBI Life Sciences, catalog number: A610961)
  7. 胰蛋白胨 (BBI Life Sciences, catalog number: A650217)
  8. NaCl (BBI Life Sciences, catalog number: A610476)
  9. 琼脂粉Agar (上海生工公司, catalog number: A505255)
  10. 琼脂糖Agarose M (上海生工公司, catalog number: A610013)
  11. pfu DNA聚合酶 (上海生工公司, catalog number: B500014)
  12. PCR产物纯化试剂盒 (上海生工公司, catalog number: B518141)
  13. DNA Marker: GeneRulerTM 100 by Plus DNA Ladder (Thermo ScientificTM, catalog number: SM0323)
  14. 限制性核酸内切酶 (Thermo ScientificTM, 中国)
  15. TreliefTM SoSoo Cloning Kit (SoSoo, catalog number: TSV-S2)
  16. Taq DNA聚合酶 (上海生工公司, catalog number: B500010)
  17. 质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit I (OMEGA, catalog number: D6943-02)
  18. 酿酒酵母EBY100 (杭州余杭紫耕生物科技服务部)
  19. pYD1质粒 (Invitrogen, catalog number: V835-01)
  20. ProteinFind® Anti-V5 Mouse Monoclonal Antibody (TransGen Biotech, catalog number: HT401-01)
  21. FITC-conjugated Rabbit anti-mouse IgG (BBI Life Sciences, catalog number: D110101)
  22. 氨苄青霉素ampicillin,Amp (BBI Life Sciences, catalog number: A610028)
  23. D-(+)-葡萄糖 (BBI Life Sciences, catalog number: A610219)
  24. D-(+)-半乳糖galactose,Gal (BBI Life Sciences, catalog number: A600215)
  25. 酪蛋白水解物casaminoacid (BBI Life Sciences, catalog number: A603060)
  26. 无氮基础培养基yeast nitrogen base, without amino acids (上海生工公司, catalog number: A610507)
  27. L-亮氨酸leucine,Leu (BBI Life Sciences, catalog number: A100811)
  28. 醋酸锂粉末 (国药, catalog number: 30109760)
  29. Tris (上海生工公司, catalog number: A610195)
  30. PEG2000 (BBI Life Sciences, catalog number: A601785)
  31. EDTA (BBI Life Sciences, catalog number: A610185)
  32. LB (Luria-Bertani) 液体培养基 (见溶液配方)
  33. 0.5 mol/L EDTA (见溶液配方)
  34. 50x TAE (tris base-acetic acid-EDTA) 母液 (见溶液配方)
  35. 1x PBS (phosphate-buffer-saline) 缓冲液 (pH 7.4) (见溶液配方)
  36. 1 mol/L LiAc (见溶液配方)
  37. 10 mg/ml Leu (见溶液配方)
  38. 10x TE (Tris-EDTA) Buffer (见溶液配方)
  39. 50% PEG2000 (见溶液配方)
  40. TE/LiAc Buffer (见溶液配方)
  41. 40% PEG2000 (见溶液配方)
  42. 10x D (dextrose) (见溶液配方)
  43. YNB (yeast nitrogen base, without amino acids) 缺陷培养基 (见溶液配方)
  44. YNB-CAA (yeast nitrogen base-casamino acid) 培养基(见溶液配方)
  45. YPD (yeast extract-peptone-dextrose) (见溶液配方)
  46. 10x Gal (galactose) (见溶液配方)

仪器设备

  1. PCR仪 (Eppendorf, model: Mastercycler Pros)
  2. 核酸电泳仪 (北京市六一仪器厂, model: DYY-12)
  3. 凝胶成像仪 (Bio-Rad, Hercules, model: USAGel DocTM EZ)
  4. 空气恒温摇床 (宁波科技园区新江南仪器有限公司, model: KYC-100B)
  5. 生化培养箱 (宁波东南仪器有限公司, model: LRH-50)
  6. 紫外分光光度计 (上海美普达仪器有限公司, model: UV-3200)
  7. 离心机 (Eppendorf, model: Centrifuge MiniSpin)
  8. 荧光显微镜 (Lecia, model: DFC450 C)
  9. 流式细胞仪 (BD, model: FACSVerse)

实验步骤

一、 重组pYD1表达载体的构建

  1. PCR扩增木聚糖基因orf6-un
    以目标基因为模板,分别用上游引物Primer-F:5' ACGATAAGGTACCAGGATCCGATTTTTGTCAAACTGCC 3'和下游引物Primer-R:5' CCCTCTAGACTCGAGCGCCCCCTCGATATAGAC 3'进行PCR扩增,PCR反应体系 (表1) (Wang et al., 2015)。

    表1. PCR反应体系


    将PCR扩增产物与6x DNA上样缓冲液以1:5的比例混合均匀,取混合液3 μl上样于1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。设置电压为120 V,进行约30 min电泳后,将凝胶置于凝胶成像系统,使用Image Lab v.5.2.1 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 观察图像并拍照 (图1)。使用PCR产物纯化试剂盒,按照其说明书方法纯化回收PCR扩增产物。


    图1. PCR扩增orf6-un基因. 泳道1-2, orf6-un基因; M, Marker.

  2. 双酶切目的基因和载体
    使用限制性内切酶分别双酶切载体和基因,酶切体系 (表2),置于37 °C恒温培养1-2 h,使用产物纯化试剂盒回收酶切产物。

    表2. 酶切体系


  3. 目标基因与载体连接
    利用同源重组的原理,通过TreliefTM SoSoo Cloning Kit同源重组试剂盒将目的基因定向克隆到线性化载体pYD1中,反应体系如表3所示。目标基因与表达载体摩尔比约为5:1,50 °C反应30 min。

    表3. 同源重组体系


  4. 重组质粒的转化
    4.1
    将10 μl连接产物与50 μl大肠杆菌TOP10F’感受态细胞小心混匀后,冰浴10~15 min。
    4.2
    将离心管置于42 °C水浴热激60 s,立即取出冰浴2~3 min。
    向离心管中加入500 μl 37 °C预热的灭菌LB液体培养基 (不含抗生素),混匀后置于37 °C摇床150 rpm恒温培养45 min,使质粒上相关的抗性标记基因表达,菌体复苏。
    4.3
    吸取100 μl已转化后的细胞,涂布于具有抗性筛选的LB固体培养基中。将平板置于室温直至液体被吸收,倒置平板37 °C恒温培养12~16 h;
    4.4
    挑取菌斑进行PCR鉴定,将筛选出的阳性转化子送公司测序。

二、 酿酒酵母感受态制备

  1. 挑取酿酒酵母EBY100单菌落于5 ml含Amp的YPD液体培养基,30 °C,200 rpm培养过夜。
  2. 取新鲜种子液100 μl接种于含10 ml YPD液体培养基的摇瓶中,30 °C,200 rpm培养至OD600为0.4~0.6。
  3. 4 °C,3,000 g,离心5 min,回收菌体。
  4. 倒去上清液,用2 ml灭菌ddH2O反复洗涤两次,4 °C,3,000 g,离心5 min。
  5. 倒去上清液,用1 ml的TE/LiAc buffer重悬沉淀。
  6. 倒去上清液,用200 μl的TE/LiAc buffer重悬沉淀,每管分装50 μl,即为酵母感受态。

三、 LiAc转化法

  1. 向50 μl酵母感受态细胞中加入5 μl重组质粒 (1~1.5 μg) 混合均匀,30 °C保温30 min,每间隔10 min混匀一次。
  2. 每管加入1 ml 40% PEG2000,重悬沉淀,30 °C保温1 h。
  3. 42 °C水浴中热激15 min。
  4. 4 °C,13,000 g,离心1 min,去上清。
  5. 每管加入1 ml YPD液体培养基,30 °C保温2 h。
  6. 取转化产物100 μl涂布于含亮氨酸的YNB固体缺陷培养基上,待液体被吸收将平板倒置,30 °C培养2~3 d。

四、 支架蛋白的表面展示

  1. 支架蛋白的表达
    挑取单菌落于5 ml YNB-CAA液体培养基,30 °C培养12~24 h。按5%的接种量将新鲜种子液接种于50 ml YNB-CAA液体培养基中,30 °C恒温培养12~24 h至OD600为1~1.5。3,000 g,4 °C离心5 min收集菌体,使用灭菌ddH2O清洗两次。加入75 ml YNB-CAA液体培养基重悬菌体,并加入终浓度为2%的半乳糖,25 °C诱导48 h后,取上清液和菌体用于后续分析。
  2. 免疫荧光分析
    将诱导后新鲜的酵母细胞 (EBY100/orf6-un) 稀释至OD600 = 0.5,设置EBY100为阴性对照。取酵母细胞体积500 μl加入V5标记的鼠抗1 μl,16 °C杂交1 h,1x PBS缓冲液反复清洗5次。加入500 μl的1x PBS缓冲液重悬沉淀,加入2.5 μl FITC标记的IgG兔抗鼠,16 °C避光杂交1 h,1x PBS缓冲液反复清洗5次后。1 ml 1x PBS缓冲液重悬沉淀,置于荧光显微镜下观察拍照 (图2)。


    图2. 免疫荧光分析木聚糖酶ORF6-UN表面展示Scale bar = 10 μm. A, C. 表面展示细胞EBY100/orf6-un; B, D. 阴性对照 EBY100.

  3. 流式细胞术分析
    参照免疫荧光抗体杂交的方法进行抗体杂交,细胞终浓度控制在~106 cell/ml。取300 μl稀释好的带有FITC抗体的酵母细胞于流式上样管中,在激发波长488 nm及发射波长535 nm的条件下,分析荧光细胞的比例。同时设置EBY100为阴性对照 (Boder et al., 1997)。

溶液配方

  1. LB液体培养基
    称取酵母提取物 (yeast extract) 2.5 g
    胰蛋白胨 (tryptone) 5.0 g
    NaCl 5.0 g
    加500 ml ddH2O溶解,121 °C,20 min
    加入2.0%琼脂粉即为LB固体培养
  2.  0.5 mol/L EDTA (ethylene diaminete traacetic acid)
    称取1.861 g EDTA·2H2O加入8.0 ml ddH2O,用NaOH调pH至8.0,ddH2O定容至10 ml
  3. 50x TAE (tris base-acetic acid-EDTA) 母液
    称取Tris 242.0 g
    冰醋酸57.1 ml
    0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 100 ml
    加ddH2O至1,000 ml,将其稀释至1x为工作液
  4. 1x PBS缓冲液 (pH 7.4)
    称取NaCl 8.0 g
    KCl 0.2 g
    Na2HPO4 1.42 g
    KH2PO4 0.27 g
    加800 ml ddH2O溶解,调pH至7.4,定容至1,000 ml
  5. 1 mol/L LiAc
    称取10.2 g醋酸锂粉末,溶于80 ml ddH2O,定容至100 ml,121 °C,20 min,4 °C保存
  6. 10 mg/mL Leu
    称取0.1 g亮氨酸粉末,溶于10 ml灭菌ddH2O中,0.22 μm无菌滤膜过滤,分装至1.5 ml离心管,-20 °C保存
  7. 10x TE Buffer
    100 ml 1 mol/L的Tris-HCl (pH 8.0),200 ml 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0),加ddH2O定容至1,000 ml,121 °C,20 min,4 °C保存
  8. 50% PEG2000
    称取50 g PEG2000粉末,溶于80 ml ddH2O,待粉末彻底溶解,定容至100 ml,121 °C,20 min,4 °C保存
  9. TE/LiAc Buffer
    1 ml 10x TE Buffer,1 ml 1 mol/L LiAc,加ddH2O定容至10 ml,4 °C保存
  10. 40% PEG2000
    10x TE Buffer和1 mol/L LiAc各1 ml与8 ml 50% PEG2000混合均匀,4 °C保存
  11. 10x D
    称取20.0 g D-葡萄糖,加ddH2O溶解并定容至100 ml,121 °C,20 min,室温放置
  12. YNB缺陷培养基
    称取0.67 g YNB溶于90 ml ddH2O,121 °C,20 min
    加10 ml 10x D,1 ml 10 mg/ml Leu,4 °C保存
    在液体培养基中加入2.0%琼脂即为YNB固体缺陷培养基
  13. YNB-CAA培养基
    称取0.67 g YNB和0.5 g CAA,加ddH2O至90 ml,121 °C,20 min,4 °C保存
  14. YPD (yeast extract peptone dextrose)
    称取酵母膏0.5 g,蛋白胨1 g,加ddH2O至45 ml,121 °C,20 min
    加5 ml灭菌的10x D,4 °C保存
  15. 10x Gal
    称取20.0 g D-半乳糖溶于100 ml ddH2O,121 °C,20 min,室温保存

致谢

国家重点研发计划重点专项子课题“农副产品利用与饲料资源开发技术集成与应用” (2018YFD0501903)

参考文献

  1. Wang, J. K., He, B., Du, W., Lou, Y., Yu, Z. and Liu, J. X. (2015). Yeast with surface displayed xylanase as a new dual purpose delivery vehicle of xylanase and yeast. Anim Feed Sci Technol 208: 44-52.
  2. Boder, E. T. and Wittrup, K. D. (1997). Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol 15(6): 553-557.
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Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:王谦, 王佳堃, 高德英. (2021). 菌酶一体化重组酵母工程菌的设计与构建. Bio-101: e2003558. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003558.
How to cite: Wang, Q., Wang, J. K. and Gao, D. Y. (2021). Design and Construction of Recombinant Yeast with Surface-displayed Enzymes. Bio-101: e2003558. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003558.
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