摘要:木质纤维素作为一种可再生的生物质资源具有极大的应用潜力。碳水化合物活性酶 (carbohydrate-active enzymes, CAZymes) 能有效解聚木质纤维素底物成为可利用的寡糖与单糖。研究基于宏转录组技术从反刍动物消化道微生物中筛选获得的碳水化合物活性酶序列,克隆候选基因并在大肠杆菌中进行异源表达,对重组酶进行分离纯化,进一步表征其生化特性。
关键词: 反刍动物, 消化道微生物, 宏转录组, CAZyme, 功能分析
材料与试剂
- 0.22 μm无菌针孔过滤器 (Sangon Biotech, catalog number: F513134-0001)
- 高保真DNA聚合酶 (2x Phanta Max Master Mix, Vazyme, catalog number: P515-02)
- DNA聚合酶 (Taq Master Mix (Dye Plus), Vazyme, catalog number: P112-02)
- DNA Marker (Fermentas, GeneRulerTM 100 by Plus DNA Ladder)
- 蛋白Marker (Fermentas, PageRulerTM Prestained Protein Ladder)
- T4 DNA连接酶 (TransGen Biotech, catalog number: FL101-01)
- 限制性内切酶 EcoRI (TaKaRa, catalog number: 1040BH);HindIII (TaKaRa, catalog number: 1060B)
- 质粒提取试剂盒 (Omega, Plasmid Mini Kit I (200) 200T)
- PCR产物纯化试剂盒 (Corning, Axygen, catalog number: AP-PCR-50)
- 割胶回收试剂盒 (Corning, Axygen, catalog number: AP-GX-50)
- 反转录试剂盒 (Toyobo, ReverTra Ace Kit)
- 酵母膏
- 胰蛋白胨
- 氨苄青霉素
- 卡那霉素
- IPTG (BBI)
- Ni-NTA agarose (Sangon Biotech, catalog number: C600033)
- 40%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺 (29:1) 溶液 (Sangon Biotech, catalog number: B546012-0500)
- EDTA·2H2O (Sangon Biotech, catalog number: A500838-0500)
- Tris (Sangon Biotech, catalog number: A610195-0500)
- 冰醋酸 (国药, catalog number: 64-19-7)
- 3,5-二硝基水杨酸 (3,5-Dinitrosalicylic acid, DNS) (Sangon Biotech, catalog number: A500420-0100)
- NaOH (国药, catalog number: 10019718)
- 酒石酸钾钠 (Sangon Biotech, catalog number: A500881-0500)
- NaCl (Sangon Biotech, catalog number: A501218-0001)
- KCl (Sangon Biotech, catalog number: A100395-0500)
- Na2HPO4 (Sangon Biotech, catalog number: A501727-0500)
- KH2PO4 (Sangon Biotech, catalog number: A100781-0500)
- SDS (Sangon Biotech, catalog number: A500228-0001)
- 甘氨酸 (Sangon Biotech, catalog number: A610235-0005)
- 过硫酸铵 (Sangon Biotech, catalog number: A500857-0100)
- 溴酚蓝 (Sangon Biotech, catalog number: A500922-0025)
- 甘油 (Sangon Biotech, catalog number: A100854-0500)
- β-巯基乙醇 (Macklin, catalog number: M6230-25ml)
- 甲醇 (国药, catalog number: 10014118)
- 考马斯亮蓝 R-250 (Sangon Biotech, catalog number: A100472-0025)
- LB (Luria-Bertani) (见溶液配方)
- 0.5 mol/L EDTA (见溶液配方)
- 50x TAE母液 (见溶液配方)
- 100 mg/ml Kan (见溶液配方)
- IPTG储存液 (见溶液配方)
- 3,5-二硝基水杨酸溶液 (见溶液配方)
- PBS缓冲液 (pH 7.4) (见溶液配方)
- 1.5 mol/L Tris-HCl (pH 8.8) (见溶液配方)
- 1 mol/L Tris-HCl (pH 6.8) (见溶液配方)
- 10% SDS (w/v) (见溶液配方)
- 50%甘油 (v/v) (见溶液配方)
- 5x SDS-PAGE缓冲液 (见溶液配方)
- 10%过硫酸铵AP (w/v) (见溶液配方)
- 1%溴酚蓝 (w/v) (见溶液配方)
- 5x SDS上样缓冲液 (见溶液配方)
- R250染色液 (见溶液配方)
- SDS-PAGE脱色液 (见溶液配方)
- NaH2PO4母液 (500 mmol/L) (见溶液配方)
- NaCl母液 (3 mol/L) (见溶液配方)
- 1 mol/L咪唑 (见溶液配方)
- Washing buffer 1 (含20 mmol/L咪唑) (见溶液配方)
- Washing buffer 2 (含50 mmol/L咪唑) (见溶液配方)
- Eluent buffer (含250 mmol/L咪唑) (见溶液配方)
- 转膜缓冲液 (见溶液配方)
- TBST (见溶液配方)
- 封闭液 (见溶液配方)
仪器设备
- 离心机 (Eppendorf, model: Centrifuge MiniSpin)
- PCR仪 (Eppendorf, model: Mastercycler Pros)
- 电子分析天平 (梅特勒-托利多, model: EL204)
- 微波炉 (格兰仕, model: D80D23NTP-7T)
- 空气恒温摇床 (宁波科技园区新江南仪器有限公司, model: KYC-100B)
- 生化培养箱 (宁波东南仪器有限公司, model: LRH-50)
- 洁净工作台 (苏州市金净净化设备科技有限公司, model: JJ-CJ-ETD)
- 水平脱色摇床 (苏州威尔实验用品有限公司, model: ZD-9560)
- 凝胶成像系统 (Molecular imager, model: GeL.Dcode XR+)
- 立式压力蒸汽灭菌器 (上海博讯实业有限公司医疗设备厂, model: YXQ-75SII)
- 超声波破碎仪 (浙江宁波/新芝, model: JY98-IIIDN)
软件和数据库
- dbCAN HMMdb v9 (http://bcb.unl.edu/dbCAN2/index.php)
- Carbohydrate-Active enZYmes Database (http://www.cazy.org)
- Pfam Database (http://pfam.xfam.org/search#tabview=tab0)
- Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)
- Oligo 6.0
实验步骤
一、CAZymes功能注释
将前期通过测序组装得到的unigenes基因,通过在线软件dbCAN HMMdb v9 (http://bcb.unl.edu/dbCAN2/index.php) 进行分析注释,该分析网站是基于CAZy数据库 (version:20200730) ,根据CAZy数据库,CAZy中一个家族通常包含多种酶,从功能注释的结果中筛选出属于至少包含一种纤维素酶家族 (Glycoside Hydrolases,GHs—GH1、GH3、GH5等;GlycosylTransferases,GTs:GT1,GT2,GT3等;Polysaccharide Lyases,PLs—PL1,PL2,PL3等;Carbohydrate Esterases,CEs—CE1,CE2,CE3等;Auxiliary Activities,AAs—AA1,AA2,AA7等) 的unigenes。将所有预测ORFs的氨基酸序列与Pfam数据库 (version 4.0) (http://pfam.xfam.org/search#tabview=tab0) 在线比对,分析结构域,进一步预测其蛋白功能,筛选出能够比对到纤维素酶家族功能域的序列作为后续研究对象 (王谦, 2012;He et al., 2019)。
二、克隆目的基因
- 引物的设计:以步骤一中筛选出的基因为模板,通过Oligo 6.0进行引物设计,加上相应的酶切位点,并送至Sangon Biotech进行合成。
- cDNA合成:以消化道微生物总RNA为模板,逆转录合成cDNA,反应体系与条件如下:
Random Primer (25 pmol/μl) | 1 μl |
总RNA | ~1 μg |
加RNase Free Water至 | 12 μl |
65 °C孵育5 min使RNA热变性,立即置于冰上。
第一步变性后的RNA溶液 | 12 μl |
5x RT Buffer | 4 μl |
dNTP Mixture (各10 mM) | 2 μl |
RNase Inhibitor (10 U/μl) | 1 μl |
ReverTra Ace | 1 μl |
加RNase Free Water至 | 20 μl |
将反应液于30 °C孵育10 min;42 °C孵育20 min;99 °C孵育5 min;4 °C孵育5 min,然后瞬时离心得到cDNA。
- 目的基因PCR扩增:以合成的cDNA为模板,利用自行设计的特异性引物PCR扩增目的基因,扩增体系如下:
2x Phanta Max Master Mix | 25 μl |
Forward primer (10 mM) | 2 μl |
Reverse primer (10 mM) | 2 μl |
cDNA模板 | 2 μl |
加ddH2O至 | 50 μl |
涡旋振荡混匀,稍离心后放入PCR仪中。扩增条件如下:
Step | 程序 |
1:95 °C | 预变性3 min |
2:95 °C | 变性30 s |
3:65 °C | 退火15 s |
4:72 °C | 延伸30 s |
Steps 2~4循环29次 |
5:72 °C | 继续延伸5 min |
6:16 °C | 保存 |
- 琼脂糖凝胶电泳检测:用1.0%琼脂糖凝胶 (1 g琼脂糖,溶于100 ml 1x TAE,再加入3 μl GoldViewer I染料) 对目的基因进行检测。取3 μl PCR产物加0.5 μl 6x DNA上样缓冲液,混匀取3 μl上样;120 V,电流400 mA,30 min;观察图像。
- 目的条带回收纯化:参照Marker条带分子量,根据目的基因实际大小,在紫外发光仪上切取目的条带胶块,参照胶回收试剂盒说明书回收纯化目的基因片段。
三、原核表达载体的构建
- 目的基因和载体双酶切:以pET-30a(+)载体为例,酶切体系及条件如下:
目的基因片段/pET-30a(+) | 1 μg |
10x buffer | 5 μl |
酶1/酶2 | 各1 μl |
加ddH2O至 | 50 μl |
混匀离心,37 °C,3 h。通过产物纯化试剂盒纯化基因片段,并通过割胶回收试剂盒回收载体片段 (具体方法参照试剂盒说明书)。
- 双酶切目的基因和载体连接:连接反应体系如下:
目的片段 | 8 μl |
载体 | 2 μl |
5 × ligation buffer | 3 μl |
T4 DNA连接酶(200 U/μl) | 1 μl |
加ddH2O至 | 15 μl |
混匀离心,24 °C保温2 h。
- 热激转化
四、阳性菌株的诱导表达及蛋白纯化
- 种子液制备:取阳性菌液在操作台中,接种于5 ml含50 μg/ml Kan的LB中,37 °C,200 rpm培养12~16 h。
目的蛋白诱导表达:取2 ml种子液接种至200 ml LB培养基,37 °C培养至OD600 = 0.5~1.0 (约3~5 h)。加入200 μl 1 mol/L的IPTG,16 °C 100 rpm诱导16~20 h。诱导表达后,6,000 × g,4 °C,离心8 min收集菌体,用事先预冷的1x PBS (pH 7.4)重新悬浮菌体。超声波破碎 (开3 s,关5 s,工作时间15 min),4 °C,10,000 × g,离心15 min,取上清;4 °C,10,000 × g,15 min,重复离心一次,所得上清即为粗酶液。 - 蛋白纯化
五、SDS-PAGE蛋白电泳
- 样品制备:超声破碎后,离心管于10,000 × g,4 °C,离心15 min取80 μl粗酶液、沉淀、FT、W1、W2、E1、E2、E3、E4,加5x 蛋白上样缓冲液,混匀后煮沸5 min,冷却至室温,10,000 × g,室温离心10 min,备用。
- 制胶:SDS-PAGE配方如下:
组成 | 12%分离胶 (ml) | 4%浓缩胶 (ml) |
ddH2O | 8.6 | 4.38 |
40% Acr-Bis | 6.0 | 0.75 |
1.5 mol/L Tris-HCl (pH 8.8) | 5.0 | |
1.0 mol/L Tris-HCl (pH 6.8) | | 0.75 |
10% SDS | 0.2 | 0.06 |
10% AP | 0.2 | 0.06 |
TEMED | 0.008 | 0.006 |
总计 | 20 | 6 |
- 电泳:90 V,20 min,待条带迁移至分离胶与浓缩胶分界处,再转换电压至120 V,电泳1.5 h左右。待溴酚蓝迁移至凝胶的底部大约1 cm时,电泳停止。
- 染色与脱色:将凝胶剥落到塑料盒中,倒入R250染料,使胶完全浸没于染料中。水平震荡摇床染色30 min左右,回收染料,并用ddH2O洗去表面的染料,加脱色液脱色 (脱色液没过凝胶表面),直至出现清晰条带。并通过标准蛋白质Marker计算蛋白分子量。
- Western-blot
六、蛋白活性测定
注:具体不同的蛋白其活性测定方法不同,这里以纤维素酶为例。
吸取60 μl 1%羧甲基纤维素钠底物加入1.5 ml离心管中,37 °C预热5 min后,加入15 μl稀释到合适浓度的酶液,混匀后37 °C反应10 min,立即加入75 μl DNS混匀,100 °C煮沸15 min。冷却至室温后测定OD540值 (Miller, 1959)
溶液配方
- LB (Luria-Bertani)
酵母膏 (Yeast extract) 5 g
胰蛋白胨 (tryptone) 10 g
NaCl 10 g
加ddH2O定容1,000 ml,分装,121 °C,20 min,4 °C放置
LB固体加入2.0%的琼脂 - 0.5 mol/L EDTA
取1.861 g EDTA·2H2O加入8.0 ml ddH2O,用NaOH调pH值到8.0,定容至10 ml - 50x TAE母液
Tris 242 g,冰醋酸57.1 ml,0.05 mol/L EDTA (pH 8.0) 100 ml,加ddH2O至1,000 ml,1x为使用液 - 100 mg/ml Kan
配制终浓度为100 mg/ml,0.22 μm无菌针孔滤膜过滤除菌,-20 °C备用 - IPTG储存液
将IPTG溶于灭菌ddH2O,配制成1 mol/L,0.22 μm无菌针孔滤膜过滤,-20 °C存放备用 - 3,5-二硝基水杨酸溶液
50.0 g 3,5-二硝基水杨酸,加入400 ml ddH2O中,缓慢加入80 g NaOH,加入150 g酒石酸钾钠,45 °C溶解,冷却后定容至5,000 ml,室温避光保存 - PBS缓冲液 (pH 7.4)
8.0 g NaCl
0.2 g KCl
1.42 g Na2HPO4
0.27 g KH2PO4
加800 ml ddH2O溶解,调pH至7.4,定容至1,000 ml,灭菌后室温保存 - 1.5 mol/L Tris-HCl (pH 8.8)
称取24.2 g Tris,加50 ml ddH2O,盐酸调pH至pH 8.8,加ddH2O至100 ml,4 °C保存 - 1 mol/L Tris-HCl (pH 6.8)
称取12.1 g Tris,加50 ml ddH2O,盐酸调pH至pH 6.8,加ddH2O至100 ml,4 °C保存 - 10% SDS (w/v)
称取10 g SDS,加ddH2O至100 ml - 50%甘油 (v/v)
50 ml甘油,加ddH2O 50 ml - 5x SDS-PAGE缓冲液
15.1 g Tris
94 g甘氨酸
5 g SDS
加ddH2O定容至1,000 ml,在室温下长期保存,稀释到1x作为工作液使用 - 10%过硫酸铵AP (w/v)
称取0.1 g过硫酸铵,加1 ml ddH2O,新鲜配制 - 1%溴酚蓝 (w/v)
称取100 mg溴酚蓝溶于10 ml ddH2O中,过滤 - 5x SDS上样缓冲液
0.6 ml 1 mol/L的Tris-HCl (pH 6.8)
5 ml 50%甘油
2 ml 10% SDS
0.5 ml β-巯基乙醇
1 ml 1%溴酚蓝
0.9 ml ddH2O
4 °C放置 - R250染色液
ddH2O 400 ml与冰乙酸100 ml,甲醇500 ml,0.25 g考马斯亮蓝,过滤 - SDS-PAGE脱色液
冰乙酸100 ml,甲醇100 ml,用ddH2O定容至1,000 ml - NaH2PO4母液 (500 mmol/L)
称取78 g NaH2P04·2H2O溶于800 ml ddH2O,定容至1,000 ml - NaCl母液 (3 mol/L)
称取174 g NaCl溶于800 ml ddH2O,定容至1,000 ml - 1 mol/L咪唑
称取68 g咪唑溶于800 ml ddH2O,定容至1,000 ml - Washing buffer 1 (含20 mmol/L咪唑)
NaH2PO4母液4 ml
NaCl母液4 ml
1 mol/L咪唑800 μl
NaOH调pH至8.0,用ddH2O定容至40 ml - Washing buffer 2 (含50 mmol/L咪唑)
NaH2PO4母液4 ml
NaCl母液4 ml
1 mol/L咪唑2 ml
NaOH调pH至8.0,用ddH2O定容至40 ml - Eluent buffer (含250 mmol/L咪唑)
NaH2PO4母液4 ml
NaCl母液4 ml
1 mol/L咪唑10 ml
NaOH调pH至8.0,用ddH2O定容至40 ml - 转膜缓冲液
称取甘氨酸2.9 g
Tris 5.8 g
SDS 0.37 g
溶于500 ml ddH2O,加入200 ml甲醇,定容至1,000 ml室温储存 - TBST
称取8.8 g NaCl,溶于800 ml ddH2O,加入20 ml 1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0) 和0.5 ml Tween-20,定容至1,000 ml,4 °C储存 - 封闭液
称取2.5 g脱脂奶粉溶于50 ml TBST,现配现用
附件
CAZymes功能注释示例数据及分析步骤
致谢
国家重点研发计划重点专项子课题“农副产品利用与饲料资源开发技术集成与应用”(2018YFD0501903)。
参考文献
- 王谦. (2012). 木聚糖酶基因的体外定向进化及其高拷贝重组酵母的构建. 杭州, 浙江大学博士论文.
- He, B., Jin, S., Cao, J. W., Mi, L. and Wang, J. K. (2019). Metatranscriptomics of the Hu sheep rumen microbiome reveals novel cellulases. Biotechnol Biofuels 12: 153.
- Miller, G. L. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Biochem 31(3): 426-428.
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:王谦, 王佳堃, 孙小宝, 曹佳雯. (2021). 反刍动物消化道微生物CAZymes基因资源的挖掘与功能分析. // 微生物组实验手册.
Bio-101: e2003559. DOI:
10.21769/BioProtoc.2003559.
How to cite: Wang, Q., Wang, J. K., Sun, X. B. and Cao, J. W. (2021). Mining and Functional Characterization of CAZymes Derived from Gastrointestinal Microbiota in Ruminants. // Microbiome Protocols eBook.
Bio-101: e2003559. DOI:
10.21769/BioProtoc.2003559.