摘要:幼龄反刍动物的粪便粘度大,蛋白质含量高,若采用普通的粪便或消化道内容物DNA提取方法难以获得高质量、高纯度的粪便DNA。本实验方法基于机械破碎裂解细胞,再通过酚氯仿溶液反复抽提样本中的核酸,采用RNase A溶液消化样本中的RNA,进一步利用商品化的吸附柱纯化核酸样品,得到高纯度的DNA。采用该方法提取的幼龄反刍动物粪便DNA能够满足微生物多样性分析等测定要求。
关键词: 幼龄反刍动物, 粪便, DNA, 提取
背景
幼龄反刍动物的胎粪水分含量低,粘稠度高,不利于DNA的提取。动物出生后数天内,体内的胎粪尚未完全排出,胎粪与消化后的奶进一步混合,使得粪便的成分更加复杂,从而加大了后续DNA提取的难度。采用普通的粪便或消化道内容物DNA提取方法难以获得高质量、高纯度的粪便DNA,无法满足后续微生物多样性分析等测定要求。为此,本文提供一种幼龄反刍动物粪便DNA的提取方法,旨在为幼龄反刍动物粪便微生物分析提供便利。
材料与试剂
- 无菌枪头
- 2 ml研磨管 (研磨仪配套或其他适配研磨仪离心管均可)
- 1.5 ml、2 ml离心管 (浙江同力信息科技有限公司, catalog number: 68800012)
- 0.1 mm、0.5 mm和2 mm氧化锆球磨珠
- Tris饱和酚溶液 (生工生物工程股份有限公司, catalog number: A504193)
- 氯仿-异戊醇,24:1 (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: 25668)
- 酚氯仿,25:24:1 (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: 77617)
- RNase A,10 mg/ml (生工生物工程股份有限公司, catalog number: B500474)
- 乙醇95% (国药集团化学试剂有限公司, catalog number: 10009128)
- 乙醇70%
- 核酸纯化吸附柱 (生工生物工程股份有限公司, catalog number: B615005)
- 灭菌超纯水
- Tris (生工生物工程股份有限公司, catalog number: A100826)
- 乙二胺四乙酸二钠盐二水 (EDTA, 生工生物工程股份有限公司, catalog number: A500838)
- NaAc·3H2O (生工生物工程股份有限公司, catalog number: A610481)
- 冰醋酸 (生工生物工程股份有限公司, catalog number: A501931)
- 3 M醋酸钠,pH 5.2 (见溶液配方)
- TE缓冲液 (见溶液配方)
仪器设备
- 研磨仪 (上海净信实业发展有限公司, catalog number: JXFSTPRP-24)
- 离心机 (赛默飞世尔科技有限公司, catalog number: SL40)
- 超净台 (上海博迅医疗生物仪器股份有限公司, catalog number: VS-840-1)
- 涡旋仪 (大龙兴创实验仪器股份公司, catalog number: MX-S)
- -20 °C冰箱
实验步骤
- 称取约0.2 g粪便样品至2 ml研磨管,加入1 ml TE缓冲液,0.1 mm和0.5 mm氧化锆球磨珠各0.15 g,2 mm氧化锆球磨珠2颗。
- 向研磨管中继续加入200 μl饱和酚溶液,使用研磨仪物理破碎,65 Hz运行30 s,停顿10 s,重复三次。
- 加入200 μl氯仿-异戊醇,在涡旋仪上充分震荡混匀,4 °C、18,500 × g离心15~30 min。
- 吸取上清液至新的2 ml离心管,加入450 μl酚氯仿,在涡旋仪上充分震荡混匀,4 °C、18,500 × g离心15~30 min。
- 重复步骤4至中间蛋白层澄清。
- 吸取上清液至新的2 ml离心管,加入450 μl氯仿-异戊醇,在涡旋仪上充分震荡混匀,4 °C、18,500 × g离心15~30 min。
- 吸取上清液至新的2 ml离心管,加入RNase A溶液至终浓度为0.04 mg/ml,37 °C水浴15 min。
- 加入1/10倍体积3 M醋酸钠 (pH 5.2) 和2倍体积95%乙醇 (-20 °C预冷),上下颠倒混匀,-20 °C 30 min以上。
- 将混合液转移至吸附柱中,4 °C、15,700 × g离心3 min,弃掉滤液。重复该过程直至混合液全部转移完毕。
- 加入500 μl 70%乙醇 (-20 °C预冷),4 °C、15,700 × g离心3 min,弃掉滤液。重复该操作一次。
- 弃掉滤液,在4 °C、15,700 × g离心5 min,将吸附柱转移到新的1.5 ml离心管中,在超净台内干燥90 s。
- 加70 μl灭菌超纯水或TE缓冲液,室温下静置2 min。4 °C、15,700 × g离心2 min。
- 将滤液重新加入吸附柱,4 °C、15,700 × g离心2 min,获得DNA样品。
结果
采用本方法提取了1-78日龄的犊牛粪便DNA,获得的DNA浓度为100-1300 ng/μl,A260/280为1.62-1.95,A260/230为1.51-2.06,DNA样本能够满足微生物多样性分析的要求。
图1. 采用本方法提取的犊牛粪便DNA琼脂糖凝胶电泳图
溶液配方
- TE缓冲液
- 3 M醋酸钠,pH 5.2
准确称取408.1 g NaAc·3H2O溶解于800 ml超纯水中,用冰醋酸调节pH至5.2,用超纯水定容至1 L。121 °C灭菌15 min。
致谢
本实验方法改编自Zoetendal et al. (2006) 人类消化道微生物DNA的提取方法,感谢Zoetendal等的研究工作。
参考文献
- Zoetendal, E. G., Heilig, H. G., Klaassens, E. S., Booijink, C. C., Kleerebezem, M., Smidt, H. and de Vos, W. M. (2006). Isolation of dna from bacterial samples of the human gastrointestinal tract. Nature Protocol 1(2): 870-3.
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:王佳堃, 杨斌, 陈宏伟. (2021). 幼龄反刍动物粪便DNA提取及注意事项. // 微生物组实验手册.
Bio-101: e2003561. DOI:
10.21769/BioProtoc.2003561.
How to cite: Wang, J. K., Yang, B. and Chen, H. W. (2021). DNA Extraction from the Faeces of Young Ruminants. // Microbiome Protocols eBook.
Bio-101: e2003561. DOI:
10.21769/BioProtoc.2003561.