反刍动物瘤胃原虫样品采集及计数方法
Methods of Sampling and Counting of Ruminal Protozoa   

材料与试剂

1. 血球计数板 (规格：XB.K.25.)
2. 胶头滴管
3. NaCl
4. 甲醛溶液
5. 甲基绿
6. 35%甲醛溶液 (见溶液配方)
7. MFS染色液 (见溶液配方)
   

仪器设备

1. 光学显微镜 (奥林巴斯CKX41，日本)

实验步骤

1. 采用负压装置在晨饲前从装有永久瘘管的反刍动物瘤胃中采集瘤胃液，经双层纱布过滤后，装入厌氧瓶中带回实验室。
2. 将1 ml瘤胃液加入2 ml MFS染色液中混匀，摇匀，4 °C保存备用。
3. 用移液枪吸取0.5 ml混合液，从盖计数板的一侧缓慢添加使之不产生气泡，"H"型玻璃槽被填满溶液后，静置10 min让原虫细胞充分沉降后镜检。
4. 用10 × 10倍显微镜计算原虫总数，并以10 × 40倍数计算不同属原虫个数。
5. 原虫分类计数：每个计数室有25个大方格，每个大方格内有16个小方格 (图1)。按照对角线统计左上、左下、右上、右下和中间5个中方格所含有的原虫总数。若原虫位于格线上，计数原则为：位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中，以减少误差。原虫数 (个/ml) = N / 5 × 25 × D × 10 × 1,000 = N × D × 5 × 10⁴。其中N：计数的5个中方格中的总数；D：稀释倍数 (曹恒春等，2008；王梦芝等，2010)。计算不同属原虫个数时参考注意事项2中形态特征与示意图。
   
   
   图1. 25 × 16血球计数板示意图
   

注意事项

1. 瘤胃液样品采集后应该立即加入MFS溶液固定染色，以防原虫自溶。
2. 瘤胃内常见原虫形态特点：
   
   1)

   内毛属 (Entodinium)
   体纤毛大部分消失，只有少部分纤毛在体前面体表具有一个复合纤毛带，可伸缩。虫体开头较平直，虫体6面定向分区，口位于前段，棒状大核靠右边。一个收缩泡，无骨板，部分种类具有尾刺。此属纤毛虫所占比例较大，约为50%左右。
   
   
   图2. 内毛属 (Entodinium) 原虫形态示意图 (400 ×)
   
   
   2)

   双毛属 (Diplodinium)
   体为近似方形，定向分6区，大核前粗后细，形状复杂，位于体左侧，染色界限不明显，小核一般位于大核上。体前有两束复合纤毛带，分别为口部和体左前部，之间有明显隆起的顶盖。多数有两个收缩泡，无骨板，有或无尾刺。
   
   
   图3. 双毛属 (Diplodinium) 原虫形态示意图 (400 ×)
   
   
   3)

   等毛属 (Isotricha)
   等毛属 (Isotricha) 虫体形态结构简单，体型较大 (108-207 μm × 73-128 μm)，但体壁较薄 (10 nm)。形状如扁平卵型，体表布满等长纤毛。有口部、微弯曲的杆状大核、小核以及1-4个不等的收缩泡。
   
   
   图4. 等毛属 (Isotricha) 原虫形态示意图 (400 ×)
   
   
   4)

   头毛属 (Ophryosolex)
   体型较大 (140-160 μm × 80-110 μm)，呈锥形或不规则，较坚硬。具有2个纤毛带，背部纤毛带在体中央形成类似带子状。有9个收缩泡，排成2列，无鳃盖，有3枚骨板，2枚在体上，一枚在体右，体后有数目不等的尾刺。
   
   
   图5. 头毛属 (Ophryosolex) 原虫形态示意图 (400 ×)
   
   
   5)

   前毛属 (Epidinium)
   体型较大且偏长(80-150 μm × 40-70 μm)，后端呈锥形。具有两个纤毛带，均在体前部，近口纤毛带靠顶端，背部左纤毛带距离顶端1/5处，2个收缩泡纵列在棒状大核左前、后部，小核位于大核左侧前沟处。无鳃盖，三个骨板，有或无尾刺。
   
   
   图6. 前毛属 (Epidinium) 原虫形态示意图 (400 ×)

溶液配方

1. 35%甲醛溶液
   取35 ml甲醛溶液，使用蒸馏水定容至100 ml。
2. MFS染色液
   8.0 g NaCl粉末与0.6 g甲基绿粉末溶于100 ml 35%甲醛溶液中，使用蒸馏水定容至1,000 ml。
   

致谢

1. 感谢国家自然科学基金（30771567）对本实验的支持。
2. 王梦芝，程欣，谢文文，张柏松，刘翔，王洪荣. (2010). 体外法研究不同油脂对瘤胃原虫吞噬细菌微循环的影响. 中国农业科学, 43(18): 3831-3837.
3. 王梦芝. 山羊瘤胃原虫与细菌吞噬关系和微生物AA变化机制的研究[D]. 扬州大学, 2008.
4. 感谢扬州大学动物科学与技术学院王梦芝所做的研究工作，对本实验提供了很大的帮助。
   

参考文献

1. 王梦芝，程欣，谢文文，张柏松，刘翔，王洪荣. (2010). 体外法研究不同油脂对 瘤胃原虫吞噬细菌微循环的影响. 中国农业科学 43(18): 3831-3837.
2. 曹恒春，王洪荣，王梦芝，徐爱秋，李国祥. (2008). 用荧光标记法研究瘤胃原虫吞噬细菌的初探. 中国畜牧杂志 29(23): 24-26.