摘要:反刍动物瘤胃中含有大量原虫,其在保持瘤胃微生态环境稳定、促进饲料分解与发酵等方面起着重要的作用。在其相关研究中,利用高通量测序 (High-throughput sequencing) 技术可以准确获得原虫的区系组成、相对丰度变化及种群多样性差异等,进而为研究原虫种群关系变化及其与宿主之间关系提供了支持。本文以18S rRNA基因序列分析为基础,介绍了利用高通量测序分析瘤胃内原虫区系组成和相对丰度变化的方法。
关键词: 瘤胃原虫, 18S rRNA, 高通量测序
材料与试剂
- 2 ml螺帽离心管
- 2 ml无菌离心管
- 1.5 ml无菌离心管
- 0.1 mm的锆珠和0.5 mm的锆珠
- 粪便基因组DNA提取试剂盒 (QIAamp DNA Stool Mini Kit,Qiagen,Germany)
- 异丙醇
- 乙醇
- NaCl
- Tris-HCl
- EDTA
- 十二烷基硫酸钠 (SDS)
- 乙酸铵
- 细胞裂解液 (见溶液配方)
- 10 mM乙酸铵溶液 (见溶液配方)
仪器设备
- 1,000 ml容量瓶
- Mini-Beadbeater研磨器 (BioSpec Products, Bartlesville, OK, USA)
- 高速离心机
- NanoDrop 1000超微量分光光度计 (Nyxor biotech, Paris, France)
软件和数据库
- UPARSE软件 (Version 7.1,http://drive5.com/uparse/)
- RDP Classifier软件 (Version 11.5,http://rdp.cme.msu.edu/)
- Silva数据库 (Version 11.9,https://www.arb-silva.de)
- QIIME软件 (Version 1.9.0,http://qiime.org)
实验步骤
- 微生物总DNA提取 (Yu和Morrison,2004)
- DNA浓度和纯度鉴定
使用NanoDrop 1000超微量分光光度计 (Nyxor biotech, Paris, France)测定提取的DNA样品浓度及纯度,取2 μl DNA溶液进行凝胶电泳检验DNA质量,DNA溶液-20 °C保存待测序。 - PCR扩增
扩增前,每个样品都将合成一组特异的由8个核苷酸组成的barcodes序列,用于区分不同的样品。瘤胃原虫18S rRNA扩增引物使用316f (GCTTTCGWTGGTAGTGTATT)和539r (CTTGCCCTCYAATCGTWCT)。PCR扩增后,PCR产物使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Germany)纯化回收。 - 瘤胃原虫18S rRNA基因文库构建
- Illumina平台的Miseq双末端测序
使用Illumina MiSeq PE 300平台测序。具体流程如下:
- 数据处理
下机数据原始格式为Fastq格式,使用QIIME软件 (Version 1.9.0, http://qiime.org) 筛选后得到高质量序列,使用UPARSE软件 (Version 7.1, http://drive5.com/uparse/) (Edgar, 2013),根据97%的相似度对序列进行归并为可操作分类单元 (operational taxonomic unit, OTU)后进行聚类分析,在聚类分析过程中去除嵌合体,得到OTU代表序列。利用RDP Classifier软件 (http://rdp.cme.msu.edu/)对每条序列进行物种分类注释,对比Silva数据库 (Version 11.9, https://www.arb-silva.de) (Lin, 2019 and Wallace, 2019 )。获得相对丰度信息表后,进行后续统计分析。群落多样性指标包括Alpha多样性指数 (Chao、ACE、Shannon、Simpson指数) ,Beta多样性指数 (bray curtis、Unifrac距离等),多元统计分析(寻找组间具有显著差异的物种,比较组内差异和组间差异的大小)。
溶液配方
- 细胞裂解液
溶液含有500 mM NaCl,50 mM Tris-HCl,50 mM EDTA和4%十二烷基硫酸钠 (SDS),使用无菌无酶水配制,调整pH至8.0。 - 10 mM乙酸铵溶液
称取0.77 g乙酸铵,加蒸馏水溶解,转移至1,000 ml容量瓶,定容至刻度,混合均匀,过滤除菌。
致谢
- 感谢国家自然科学基金(30771567)对本实验的支持。
- 王梦芝, 蔡缪荧, 史成林, 张柏松, 郝志敏, 王洪荣. (2020) ITS1 rDNA序列用于瘤胃原虫研究可行性的探讨. 饲料工业, (S2): 109-116.
- 王梦芝 (2008). 山羊瘤胃原虫与细菌吞噬关系和微生物AA变化机制的研究. 扬州大学.
- 感谢扬州大学动物科学与技术学院王梦芝所做的研究工作,对本实验提供了很大的帮助。
参考文献
- Yu, Z. and Morrison, M. (2004). Improved extraction of PCR-quality community DNA from digesta and fecal samples. Biotechniques 36(5): 808-812.
- Edgar, R. C. (2013). UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nat Methods 10(10): 996-998.
- Lin, L., Xie, F., Sun, D., Liu, J., Zhu, W. and Mao, S. (2019). Ruminal microbiome-host crosstalk stimulates the development of the ruminal epithelium in a lamb model. Microbiome 7(1): 83.
- Wallace, R. J., Sasson, G., Garnsworthy, P. C., Tapio, I., Gregson, E., Bani, P., Huhtanen, P., Bayat, A. R., Strozzi, F., Biscarini, F., Snelling, T. J., Saunders, N., Potterton, S. L., Craigon, J., Minuti, A., Trevisi, E., Callegari, M. L., Cappelli, F. P., Cabezas-Garcia, E. H., Vilkki, J., Pinares-Patino, C., Fliegerova, K. O., Mrazek, J., Sechovcova, H., Kopecny, J., Bonin, A., Boyer, F., Taberlet, P., Kokou, F., Halperin, E., Williams, J. L., Shingfield, K. J. and Mizrahi, I. (2019). A heritable subset of the core rumen microbiome dictates dairy cow productivity and emissions. Sci Adv 5(7): eaav8391.
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:高健, 甄永康, 王梦芝, 王洪荣. (2021). 反刍动物瘤胃原虫18S rRNA基因测序分析技术. // 微生物组实验手册.
Bio-101: e2003580. DOI:
10.21769/BioProtoc.2003580.
How to cite: Gao, J., Zhen, Y. K., Wang, M. Z. and Wang, H. R. (2021). 18S rRNA Gene Sequencing and Analysis of Ruminal Protozoa. // Microbiome Protocols eBook.
Bio-101: e2003580. DOI:
10.21769/BioProtoc.2003580.