反刍动物瘤胃原虫18S rRNA基因测序分析技术
18S rRNA Gene Sequencing and Analysis of Ruminal Protozoa   

材料与试剂

1. 2 ml螺帽离心管
2. 2 ml无菌离心管
3. 1.5 ml无菌离心管
4. 0.1 mm的锆珠和0.5 mm的锆珠
5. 粪便基因组DNA提取试剂盒 (QIAamp DNA Stool Mini Kit，Qiagen，Germany)
6. 异丙醇
7. 乙醇
8. NaCl
9. Tris-HCl
10. EDTA
11. 十二烷基硫酸钠 (SDS)
12. 乙酸铵
13. 细胞裂解液 (见溶液配方)
14. 10 mM乙酸铵溶液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 1,000 ml容量瓶
2. Mini-Beadbeater研磨器 (BioSpec Products, Bartlesville, OK, USA)
3. 高速离心机
4. NanoDrop 1000超微量分光光度计 (Nyxor biotech, Paris, France)
   

软件和数据库

1. UPARSE软件 (Version 7.1，http://drive5.com/uparse/)
2. RDP Classifier软件 (Version 11.5，http://rdp.cme.msu.edu/)
3. Silva数据库 (Version 11.9，https://www.arb-silva.de)
4. QIIME软件 (Version 1.9.0，http://qiime.org)
   

实验步骤

1. 微生物总DNA提取 (Yu和Morrison，2004)
   
   1.1

   细胞裂解
   

   1)

   称取0.25 g瘤胃内容物加入无菌的2 ml螺帽离心管，加入1 ml裂解液和0.4 g无菌的氧化锆珠 (0.1 mm的锆珠0.3 g和0.5 mm的锆珠0.1 g)；

   2)

   在Mini-Beadbeater研磨器以最大速度匀浆3 min；

   3)

   70 °C孵育15 min，每5 min用手缓慢振荡一次；

   4)

   使用高速离心机于4 °C，16,000 × g离心5 min，转移上清液至无菌的2 ml离心管；

   5)

   沉淀中加入300 μl新鲜裂解液，重复上述(2) ~ (4)步，收集上清液。
   1.2

   核酸收集
   

   1)

   收集的上清液加入260 μl乙酸铵 (10 mM)，混匀，在冰上孵育5 min；

   2)

   使用高速离心机于4 °C，16,000 × g离心10 min；

   3)

   吸取上清液到2个1.5 ml无菌离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，在冰上孵育30 min；

   4)

   使用高速离心机于4 °C，16,000 × g离心15 min，使用移液枪去除上清液，沉淀物 (核酸) 使用70%乙醇溶液清洗并放置在真空条件下干燥3 min；

   5)

   核酸沉淀使用100 μl TE缓冲液 (Tris-EDTA) 重新溶解，合并提取的核酸溶液样品。
   1.3

   DNA纯化
   

   1)

   核酸溶液样品中加入2 μl RNA酶溶液 (10 mg/ml，无DNA酶)，于37 °C孵育15 min；

   2)

   样品中加入15 μl蛋白酶K和AL缓冲液 (QIAamp DNA Stool Mini Kit)，混匀，于70 °C孵育10 min；

   3)

   样品中加入200 μl乙醇，混匀，转移至QIAamp柱，使用高速离心机于16,000 × g离心1 min；

   4)

   弃收集管中的液体，在QIAamp柱中加入500 μl AW1缓冲液 (Qiagen)，室温下于16,000 × g离心1 min；

   5)

   弃收集管中的液体，在QIAamp柱中加入500 μl AW2缓冲液 (Qiagen)，室温下于16,000 × g离心1 min；

   6)

   弃收集管中的液体，将QIAamp柱在室温下于16,000 × g离心1 min去除残留液体；

   7)

   在QIAamp柱中加入200 μl AE缓冲液 (Qiagen)，室温孵育2 min。室温下于16,000 × g离心1 min收集DNA溶液。
2. DNA浓度和纯度鉴定
   使用NanoDrop 1000超微量分光光度计 (Nyxor biotech, Paris, France)测定提取的DNA样品浓度及纯度，取2 μl DNA溶液进行凝胶电泳检验DNA质量，DNA溶液-20 °C保存待测序。
3. PCR扩增
   扩增前，每个样品都将合成一组特异的由8个核苷酸组成的barcodes序列，用于区分不同的样品。瘤胃原虫18S rRNA扩增引物使用316f (GCTTTCGWTGGTAGTGTATT)和539r (CTTGCCCTCYAATCGTWCT)。PCR扩增后，PCR产物使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Germany)纯化回收。
4. 瘤胃原虫18S rRNA基因文库构建
   
   4.1

   在剪切酶的作用下，先将18S rRNA基因片段化；
   4.2

   然后对基因片段进行末端补平并磷酸化，在3’端加碱基A；
   4.3

   连接“Y”形接头；
   4.4

   对DNA进行片段选择，使用磁珠筛选，去除接头自连片段；
   4.5

   使用NaOH将双链DNA片段变性为单链DNA片段；
   4.6

   利用PCR扩增进行文库模版的富集；
   4.7

   再次进行片段选择，纯化文库备用。
5. Illumina平台的Miseq双末端测序
   使用Illumina MiSeq PE 300平台测序。具体流程如下：
   
   5.1

   DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上；
   5.2

   另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥” (bridge)；
   5.3

   PCR扩增，产生DNA簇；
   5.4

   DNA扩增子线性化成为单链；
   5.5

   加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只合成一个碱基；
   5.6

   用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；
   5.7

   将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸；
   5.8

   统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。
6. 数据处理
   下机数据原始格式为Fastq格式，使用QIIME软件 (Version 1.9.0, http://qiime.org) 筛选后得到高质量序列，使用UPARSE软件 (Version 7.1, http://drive5.com/uparse/) (Edgar, 2013)，根据97%的相似度对序列进行归并为可操作分类单元 (operational taxonomic unit, OTU)后进行聚类分析，在聚类分析过程中去除嵌合体，得到OTU代表序列。利用RDP Classifier软件 (http://rdp.cme.msu.edu/)对每条序列进行物种分类注释，对比Silva数据库 (Version 11.9, https://www.arb-silva.de) (Lin, 2019 and Wallace, 2019 )。获得相对丰度信息表后，进行后续统计分析。群落多样性指标包括Alpha多样性指数 (Chao、ACE、Shannon、Simpson指数) ，Beta多样性指数 (bray curtis、Unifrac距离等)，多元统计分析（寻找组间具有显著差异的物种，比较组内差异和组间差异的大小）。
   

溶液配方

1. 细胞裂解液
   溶液含有500 mM NaCl，50 mM Tris-HCl，50 mM EDTA和4%十二烷基硫酸钠 (SDS)，使用无菌无酶水配制，调整pH至8.0。
2. 10 mM乙酸铵溶液
   称取0.77 g乙酸铵，加蒸馏水溶解，转移至1,000 ml容量瓶，定容至刻度，混合均匀，过滤除菌。
   

致谢

1. 感谢国家自然科学基金（30771567）对本实验的支持。
2. 王梦芝, 蔡缪荧, 史成林, 张柏松, 郝志敏, 王洪荣. (2020) ITS1 rDNA序列用于瘤胃原虫研究可行性的探讨. 饲料工业, (S2): 109-116.
3. 王梦芝 (2008). 山羊瘤胃原虫与细菌吞噬关系和微生物AA变化机制的研究. 扬州大学.
4. 感谢扬州大学动物科学与技术学院王梦芝所做的研究工作，对本实验提供了很大的帮助。
   

参考文献

1. Yu, Z. and Morrison, M. (2004). Improved extraction of PCR-quality community DNA from digesta and fecal samples. Biotechniques 36(5): 808-812.
2. Edgar, R. C. (2013). UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nat Methods 10(10): 996-998.
3. Lin, L., Xie, F., Sun, D., Liu, J., Zhu, W. and Mao, S. (2019). Ruminal microbiome-host crosstalk stimulates the development of the ruminal epithelium in a lamb model. Microbiome 7(1): 83.
4. Wallace, R. J., Sasson, G., Garnsworthy, P. C., Tapio, I., Gregson, E., Bani, P., Huhtanen, P., Bayat, A. R., Strozzi, F., Biscarini, F., Snelling, T. J., Saunders, N., Potterton, S. L., Craigon, J., Minuti, A., Trevisi, E., Callegari, M. L., Cappelli, F. P., Cabezas-Garcia, E. H., Vilkki, J., Pinares-Patino, C., Fliegerova, K. O., Mrazek, J., Sechovcova, H., Kopecny, J., Bonin, A., Boyer, F., Taberlet, P., Kokou, F., Halperin, E., Williams, J. L., Shingfield, K. J. and Mizrahi, I. (2019). A heritable subset of the core rumen microbiome dictates dairy cow productivity and emissions. Sci Adv 5(7): eaav8391.