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反刍动物瘤胃原虫的分离培养与形态学分析
Separation and Morphological Analysis of Protozoa from Rumen Contents   

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摘要:反刍动物瘤胃中含有大量原虫,其在保持瘤胃微生态环境稳定、促进饲料分解与发酵等方面起着重要的作用。瘤胃原虫主要有内毛属、双毛属、等毛属、头毛属、前毛属和坚甲属,其胞核的数量与形态是分类的重要标志。本文介绍了在厌氧工作站中,先通过显微镜进行原虫细胞分选,再培养瘤胃原虫,最后在显微镜下对瘤胃原虫进行形态学分析。

关键词: 瘤胃原虫, 微生物分离, 形态学分析

材料与试剂

  1. 16 × 150 mm培养管 (配备橡胶塞)
  2. 毛细吸管
  3. 大口径吸管
  4. 载玻片
  5. 纱布
  6. CO2气体,纯度为99.999%
  7. 磷酸氢二钾,K2HPO4
  8. 磷酸二氢钾,KH2PO4
  9. 硫酸铵,(NH4)2SO4
  10. 氯化钠,NaCl
  11. 硫酸镁,MgSO4
  12. 二水合氯化钙,CaCl2·2H2O
  13. 半胱氨酸盐酸盐
  14. 碳酸钠,Na₂CO₃
  15. 刃天青
  16. 乙酸钠,CH3COONa
  17. 碳酸氢钠,NaHCO3
  18. 小麦粉
  19. 鸭茅粉
  20. 无氧稀释液溶液 (见溶液配方)
  21. 培养液M (见溶液配方)
  22. 培养液SP (见溶液配方)
  23. 底物悬液 (见溶液配方)

仪器设备

  1.  40目筛
  2.  解剖显微镜
  3.  恒温水浴锅
  4.  厌氧工作站
  5.  离心机

实验步骤

  1.  晨饲后,采用负压装置从装有永久瘘管的反刍动物瘤胃中采集瘤胃液,经双层纱布过滤后,放入到充CO2并39 °C预温保温瓶中带回实验室。
  2.  过滤的瘤胃液放入到厌氧工作站中,使用无氧稀释液依次进行十倍梯度稀释 (10-2、10-3或其他倍数,以每个计数格6-8只原虫为准),稀释后的瘤胃液放置于厌氧工作站中39 °C保存。
  3.  吸取0.1 ml稀释后的瘤胃液至载玻片,在厌氧工作站中通过显微镜检查 (100 ×),并分离原虫。
  4.  将单个原虫细胞在显微镜下吸取到毛细管中,并在转移到培养管之前检查原虫细胞是否存活,转移原虫细胞至16 × 150 mm培养管中,每个培养管放置1-3个细 胞。
  5.  培养管中加入10 ml培养液 (根据不同的原虫属生长状态选择不同的培养液,如前毛属原虫使用培养液M培养生长较好,内毛属原虫适合使用培养液SP培养生长较好) 和1 ml底物悬液,厌氧封闭培养管,将培养管以10°夹角放置于39 °C的厌氧工作站中培养。
  6.  每天在厌氧工作站中加入0.1 ml底物悬液至培养管中,在解剖显微镜下观察原虫 生长状态,生长到每个计数格6-8只原虫为准。
  7.  在厌氧工作站中将培养的原虫每周转接种至新的培养管两次,使用大口径吸管吸 取5 ml培养液,加入到已经装有5 ml新鲜培养液和0.1 ml底物悬液的培养管 中,在接种到新培养管后,每日进行观察,以每个计数格6-8只原虫为准。
  8.  使用解剖显微镜,在放大400 ×条件下根据原虫大小和形态学对培养的原虫进行 鉴定,具体形态可参考Dehority (1993) 和注意事项中常见原虫形态和图片。

注意事项

瘤胃内常见原虫形态特点:

  1.  内毛属 (Entodinium) 平均体型约2-168 μm × 13-104 μm,体纤毛大部分消失,只有少部分纤毛在体前面体表具有一个复合纤毛带,可伸缩。虫体开头较平直,虫体6面定向分区,口位于前段,棒状大核靠右边。一个收缩泡,无骨板,部分种类具有尾刺。此属纤毛虫所占比例较大,约为50%左右。


    图1. 内毛属 (Entodinium) 原虫形态示意图 (400 ×)

  2.  双毛属 (Diplodinium) 体为近似方形 (77-86 μm × 53-61 μm),定向分6 区,大核前粗后细,形状复杂,位于体左侧,染色界限不明显,小核一般位于大核上。体前有两束复合纤毛带,分别为口部和体左前部,之间有明显隆起的顶盖。多数有两个收缩泡,无骨板,有或无尾刺。


    图2. 双毛属 (Diplodinium) 原虫形态示意图 (400 ×)

  3.  等毛属 (Isotricha) 虫体形态结构简单,体型较大 (108-207 μm × 73-128 μm),但体壁较薄 (10 nm)。形状如扁平卵型,体表布满等长纤毛。有口部、微弯曲的杆状大核、小核以及1-4个不等的收缩泡。


    图3. 等毛属 (Isotricha) 原虫形态示意图 (400 ×)

  4.  头毛属 (Ophryosolex) 体型较大 (140-160 μm × 80-110 μm),呈锥形或不规则,较坚硬。具2个纤毛带,背部纤毛带在体中央形成类似带子状。有9个收缩泡,排成2列,无鳃盖,有3枚骨板,2 枚在体上,一枚在体右,体后有数目不等的尾刺。


    图4. 头毛属 (Ophryosolex) 原虫形态示意图 (400 ×)

  5.  前毛属 (Epidinium) 体型较大且偏长 (80-150 μm × 40-70 μm),后端呈锥形。具有两个纤毛带,均在体前部,近口纤毛带靠顶端,背部左纤毛带距离顶端1/5处,2个收缩泡纵列在棒状大核左前、后部,小核位于大核左侧前沟处。无鳃盖,三个骨板,有或无尾刺。


    图5. 前毛属 (Epidinium) 原虫形态示意图 (400 ×)

  6.  坚甲属 (Osteracodinium) 体为椭圆形 (100-130 μm × 50-60 μm),主要特征为一块宽大的骨板占据虫体的上面体表的大半部分。前部具有两个纤毛带。大核杆状较长,左侧中间有一凹陷,小核位于其中。6个以上收缩泡纵列与大核左面。


    图6. 坚甲属 (Osteracodinium) 原虫形态示意图 (400 ×)

溶液配方

  1.  无氧稀释液 (Bryant and Burkey, 1953)
    100 ml无氧稀释液包含45 ml矿物液No.1 (0.3% K2HPO4),45 ml矿物液No.2 (0.3% KH2PO4,0.6% (NH4)2SO4,0.6% NaCl,0.06% MgSO4和0.08% CaCl2·2H2O),加入1.67 ml 3%半胱氨酸盐酸盐,5 ml 0.3%碳酸钠溶液,加蒸馏水至100 ml。此外,无氧稀释液中还包含0.0001%刃天青。稀释液放入高压蒸汽灭菌器灭菌 (121 °C,0.1 MPa灭菌20 min),当打开灭菌器时,立即使用无菌橡胶塞封闭稀释液,待稀释液温度冷却至45-50 °C时,向溶液中充入CO2至饱和。
  2.  培养液M (Dehority, 1998)
    每100 ml培养液M包含50 ml混合矿物溶液M (6.0 g/L NaCl,0.2 g/L MgSO4,0.26 g/L CaCl2·2H2O和2.0 g/L KH2PO4),5 ml 1.5%乙酸钠溶液,8.33 ml 6%碳酸氢钠溶液,26 ml蒸馏水,10 ml瘤胃液 (瘤胃液为经2层纱布过滤,1,000 × g离心10 min后的上清液),0.67 ml含3%半胱氨酸盐酸盐溶液 (在氮气条件下厌氧保存在无菌离心管中,直到使用前取出)。半胱氨酸添加前需混合培养液通CO2 15-20 min,如果需要,可以使用1 mol/L NaOH或者1 mol/L HCl调节溶液pH至6.6-6.8,然后在厌氧条件下添加含3%半胱氨酸盐酸盐溶液。培养液M使用高压蒸汽灭菌器灭菌 (121 °C,0.1 MPa灭菌20 min)。
  3. 培养液SP (Dehority, 1998)
    每100 ml培养液 SP包含25 ml混合矿物溶液SP-1 (20 g/L K2HPO4),25 ml混合矿物溶液SP-2 (16 g/L KH2PO4,4.0 g/L NaCl,0.212 g/L CaCl2·2H2O和0.154 g/L MgSO4),10 ml瘤胃液 (瘤胃液为经2层纱布过滤,1,000 × g离心10 min后的上清液),10 ml 6%碳酸氢钠溶液,29.33 ml蒸馏水,0.67 ml含3%半胱氨酸盐酸盐溶液 (在氮气条件下厌氧保存在无菌离心管中,直到使用前取出)。半胱氨酸添加前需混合培养液通CO2 15-20 min,如果需要,可以使用NaOH或者HCl调节溶液pH至6.6-6.8,然后在厌氧条件下添加含3%半胱氨酸盐酸盐溶液。培养液SP使用高压蒸汽灭菌器灭菌 (121 °C,0.1 MPa灭菌20 min)。
  4.  底物悬液
    每100 ml蒸馏水中加入1.5 g小麦粉,1.0 g鸭茅粉制作底物悬液,小麦粉和鸭茅粉均粉碎过40-60目标准筛,底物悬液通CO2 15-20 min以保证厌氧。底物悬液使用高压蒸汽灭菌器灭菌 (121 °C,0.1 MPa灭菌20 min)。底物悬液冷冻保存,使用前解冻。

致谢

感谢国家自然科学基金(30771567)对本实验的支持。感谢扬州大学动物科学与技术学院王梦芝所做的研究工作,对本实验提供了很大的帮助。已发表的使用过本实验方案的文章:王梦芝,程欣,谢文文,张柏松,刘翔,王洪荣. (2010). 体外法研究不同油脂对瘤胃原虫吞噬细菌微循环的影响. 中国农业科学 43(18): 3831-3837. 王梦芝. (2008). 山羊瘤胃原虫与细菌吞噬关系和微生物AA变化机制的研究. 博士学位论文. 扬州大学.

参考文献

  1. Dehority, B. A. (1998). Generation times of Epidinium caudatum and Entodinium caudatum, determined in vitro by transferring at various time intervals. J Anim Sci 76(4): 1189-1196.
  2. Bryant, M. P. and Burkey, L. A. (1953). Cultural methods and some characteristics of some of the more numerous groups of bacteria in the bovine rumen. J Dairy Sci 36: 205-217.
  3. Dehority, B. A. (1993). Laboratory manual for classification and morphology of rumen cilate protozoa. CRC Press, Boca Raton, FL. ISBN: 08-493-48757.
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Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:高健, 甄永康, 王梦芝, 王洪荣. (2021). 反刍动物瘤胃原虫的分离培养与形态学分析. Bio-101: e2003581. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003581.
How to cite: Gao, J., Zhen, Y. K., Wang, M. Z. and Wang, H. R. (2021). Separation and Morphological Analysis of Protozoa from Rumen Contents. Bio-101: e2003581. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003581.
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