基于18S rRNA基因和内部转录间隔区ITS扩增子分析的功能微生物鉴定
在真核细胞中,18S 核糖体小亚基rRNA基因进化速率比较保守,在系统发育中较适用于种级以上阶元的分类;ITS是内部转录间隔区,属于中度保守的区域,其保守性基本上表现为种内相对一致,种间差异比较明显,表现出极大的序列多态性,被广泛用于生物种间系统发育和研究。
将筛选获得的耐镉菌株在PDA培养基上进行划线活化,挑取少量耐镉菌株的菌落,涂抹于1.5 ml EP管底部,盖上EP管盖子,放入微波炉中微波2 min,取出冷却30 s,并重复三次。向管中加入45 μl裂解液后,放入沸水中煮15 min,自然冷却后,16,100
× g离心5 min,取上清液作为模板进行PCR扩增,PCR扩增体系如表3所示。采用真菌18S rRNA基因鉴定引物和内部转录间隔区ITS引物进行扩增子分析的功能微生物鉴定。真菌18S rRNA基因鉴定引物,NS1:5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3',fung:5'-ATTCCCCGTTACCCGTTG-3'。真菌内部转录间隔区ITS引物,ITS-4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3',ITS-5:5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3' (White
et al., 1999)。
50 μl扩增体系如表3:
表3. 基于18S rRNA基因扩增子分析的功能微生物鉴定PCR扩增体系 菌液 | 1 μl |
NS1 (ITS-4) | 2 μl |
fung (ITS-5) | 2 μl |
dNTP Mix (10 mM each) | 1 μl |
2x Phanta Max Buffera | 25 μl |
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | 1 μl |
ddH2O 总体积 | 18 μl 50 μl |
PCR扩增条件为:95 °C预变性5 min, 95 °C变性30 s, 52 °C退火30 s, 72 °C延伸60 s,共35个循环,72 °C 10 min。
扩增时,阴性对照使用ddH2O作为模板,以检测整个加样和PCR过程是否存在污染。阳性对照采用已知菌属类型的细菌如毕赤酵母GS115菌株作为模板,检测PCR扩增的特异性。PCR产物的纯化和测序由北京擎科新业生物技术有限公司完成。测序结果通过BLAST程序与NCBI 数据库(
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 中的已有菌株序列进行同源性比对,通过分析Identity的数值大小 (Identity大于98%可确定其菌属相似性) 来分析菌株的菌属类别,根据农业农村部微生物肥料和食用菌菌种质量监督检验测试中心公布的《菌种安全等级调整目录及依据》,选择评定等级为1级 (免做毒理学试验) 的安全菌株进行水稻与微生物互作实验。