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内生镰刀菌基因组染色体级别组装和注释
Chromosome-Scale Genome Assembly and Annotation Method of Endophyte Fusarium    

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摘要: 镰刀菌(Fusarium)是一种丝状真菌,其包含许多农业上重要的植物病原体,也是霉菌毒素的产生者和机会性感染人类的病原体,但是我们在前期实验中发现了两种可以促进植物生长的内生镰刀菌:黄色镰刀菌(F. culmorum)和假禾谷镰刀菌(F. pseudograminearum),为了进一步解释这种现象的原因,我们对其进行了全基因组测序(WGS)。我们主要利用PacBio三代测序和Illumina二代测序技术相结合的方法,得到染色体级别的基因组。进一步结合de novo注释和同源的预测结果得到基因的结构注释,结合NR等数据库对基因集得到了功能注释,最终得到染色体级别的内生镰刀菌基因组组装结果和高质量的基因组注释结果。为后续研究人员开展内生镰刀菌比较基因组、进化选择分析、功能研究和共生互作提供高质量的参考基因组信息。

关键词: PacBio测序, Illumina测序, 内生镰刀菌

材料与试剂

  1. 内生镰刀菌Fusarium culmorum Class2-1B、Fusarium pseudograminearum Class2-1C,分离自沿海滩涂植物滨麦Leymus mollis,与植物共生可以促进植物生长和提高植物耐盐性 (Rodriguez et al.,2008; Redman et al.,2011; Pan et al.,2018)

仪器设备

  1. 三代测序仪 (Pacific Biosciences PacBio RS II)
  2. 二代测序仪 (Illumina HiSeq 2500)

软件和数据库

  1. MECAT2 (https://github.com/xiaochuanle/MECAT2)
  2. BUSCO v2.0 (https://busco.ezlab.org/)
  3. tRNAscan-SE (http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE)
  4. RepeatModeler: http://www.repeatmasker.org/RepeatModeler
  5. RepeatMasker: http://repeatmasker.org
  6. NR (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/about/nonredundantproteins)
  7. Swiss-Prot (https://www.uniprot.org/statistics/Swiss-Prot)
  8. KEGG databases (https://www.genome.jp/kegg/kegg1.html)
  9. Repbase database: https://www.girinst.org/server/RepBase
  10. Fungi odb10 dataset: https://busco.ezlab.org/frames/fungi.htm
  11. TRF (Tandem repeats finder) http://tandem.bu.edu/trf/trf.unix.help.html
  12. LTR_FINDER http://tlife.fudan.edu.cn/tlife/ltr_finder
  13. Augustus http://bioinf.uni-greifswald.de/augustus/
  14. GlimmerHMM http://ccb.jhu.edu/software/glimmerhmm/
  15. Piler http://www.drive5.com/piler
  16. RepeatScout https://github.com/mmcco/RepeatScout
  17. TrEMBL https://www.uniprot.org/statistics/TrEMBL
  18. Interpro https://www.ebi.ac.uk/interpro/
  19. Maker http://www.yandell-lab.org/software/maker.html
  20. Fusarium culmorum strain PV, whole genome shotgun sequencing project https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/PVEM00000000
  21. Fusarium pseudograminearum CS3096, whole genome shotgun sequencing project https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AFNW00000000

实验步骤

一、测序

  1. 使用太平洋生物科学公司开发的单分子实时 (SMRT) 测序和Illumina HiSeq 2500测序技术来组装完整的基因组。测序在北京诺禾致源生物信息技术有限公司进行。
  2. 取单孢分离后培养15天的内生镰刀菌Fusarium culmorumFusarium pseudograminearum PDA平板,使用Omega真菌DNA提取试剂盒提取DNA,DNA浓度大于100 ng/μl,DNA纯度 (OD260/280 在1.8-2.0 之间;OD260/230 在2.0-2.2 之间) ,使用50 mg DNA构建PacBio和Illumina测序文库。
  3. 对PacBio文库,构建每个菌株的20 kb插入片段大小的标准SMRTbell文库,用PacBio Sequel II系统对PacBio长读序列进行测序。
  4. 为了完善基于PacBio long-read的基因组组装,在Illumina HiSeq 2500上对插入大小为500 bp的双端Illumina DNA文库进行了测序。
  5. 基于Illumina Short Reads的数据,分析了两株内生镰刀菌基因组的K-mer分布,并估计了两株内生镰刀菌基因组的大小。


    图 1. Illumina和PacBio测序流程图

    图1展示了第二代测序Illumina和第三代测序PacBio技术的测序流程,结合二代和三代测序数据进行了高质量的基因组组装。


    图 2. 真菌染色体结构模式图

    图1模式图展示了真菌的染色体两端具有端粒结构,在基因组组装中,染色体端粒到端粒的组装代表染色体的完整性,也是高质量基因组组装结果的标志。

二、基因组组装和注释

  1. 获得了16.7 GB的long-read数据F. culmorum Class2-1B,其中Scaffold N50的长度为9.63 M;而F. pseudograminearum Class2-1C,获得了19.7 GB的long-read数据,Scaffold N50的长度为9.15 M。
  2. 基于PacBio测序数据,我们使用MECAT2来进行基因组的组装.MECAT2是一个超快速的准确比对,误差校正、组装工具。利用MECAT2进行了基因组组装和纠错,读取的文件格式为FASTA,基因组大小设置为40 Mb。MECAT2首先利用reads相互比对进行纠错,生成consensus序列。然后再把纠错后的最长的30X reads与低质量的reads进行比对,利用overlap对低质量序列进行纠正。最后,根据reads间的高质量重叠关系进行组装。然后使用Pilon (v1.22) 进行两轮纠错,接下来,我们对以上的组装结果再进行Polish,消除其中的Indel错误。因为三代Pacbio 数据有很高的错误率,所以在使用三代 Pacbio 数据完成组装之后,依然存在少量的Indel,需要将二代测序clean数据用bwa比对到mecat的组装结果上,结合比对结果文件,用pilon纠错。最后我们将二代小片段数据再比对回polish后的序列,用pilon再次对组装结果进行纠错。
  3. MECAT2的软件参数,在config配置文件中,如下
    PROJECT=F. culmorum #项目名称
    RAWREADS=m54220.fasta #处理的原始reads(FASTA格式)
    GENOME_SIZE=40000000 #基因组大小为40000000 bp。
    THREADS=20 #使用20个CPU线程
    MIN_READ_LENGTH=2000 #用于纠错和修建的reads的最低长度为2000 bp。
    CNS_OVLP_OPTIONS="" #在纠错阶段是检测候选overlap的参数, 会传给mecat2pw
    CNS_OPTIONS="-r 0.6 -a 1000 -c 4 -l 2000" #原始reads纠错参数,传递给mecat2cns
    TRIM_OVLP_OPTIONS="-B" #在trim阶段,用于检测重叠的参数,会传给v2asmpm
    ASM_OVLP_OPTIONS="-n 100 -z 10 -b 2000 -e 0.5 -j 1 -u 0 -a 400" #在组装阶段,用于检测overlap的参数,传给v2asmpm.sh
    FSA_OL_FILTER_OPTIONS="--max_overhang=-1 --min_identity=-1" #过滤overlap的参数,传递给fsa_ol_filter
    FSA_ASSEMBLE_OPTIONS="" #组装trimm reads的参数, 传给v2asmpm
    USE_GRID=false #无多个计算节点
    CLEANUP=0 #运行结束后不删除MECAT2的中间文件。
    CNS_OUTPUT_COVERAGE=30 #选择30倍的最长纠错覆盖后,将reads进行trim和组装。
    GRID_NODE=0 #当USE_GRID=1时,设置用到的计算节点数,单节点服务器不需要设置。

    Pilon (v1.22) 主要参数:
    --changes 指定生成一个列出output.fasta中更改的文件
    --vcf #指定生成vcf文件
    --tracks #vcf文件将包含QE(质量加权)数据
    --diploid #样本来自二倍体有机体;最终会影响杂合子SNPs的检测。
    --fix bases #尝试解决的问题类别用逗号分隔。
  4. F. culmorum Class2-1B和F. pseudograminearum Class2-1C都分别得到了6和7个Scaffold,参照两株镰刀菌的参考基因组:F. culmorum PV,F. pseudograminearum CS3096 (Schmidt et al., 2018; Gardiner et al., 2012)。端粒是真核生物染色体末端的DNA重复序列,作用是保持染色体的完整性和控制细胞分裂周期。将F. culmorum组装成的四条染色体,其中两条是端粒对端粒,而另外两条只在一端有一个已识别的端粒。将F. pseudograminearum组装成的四条染色体,其中三条两端都有端粒结构,而另外一条只在一端有一个已识别的端粒。在Scaffold末端发现了TTAGGG的串联重复序列 (或互补DNA链序列,AATCCC)。F. culmorum和F. pseudograminearum的Scaffold至少有一端含有端粒结构,每条Scaffold都接近完整染色体的长度 (Aksenova and Mirkin, 2019)。如上所示, 两株内生镰刀菌基因组的染色体都含有图2中的端粒结构,说明我们得到了两株高质量组装的内生镰刀菌基因组。通过BLAST搜索鉴定了F. culmorum中的2个短Scaffold为线粒体基因组,总GC含量为31.2%。同样,通过BLAST搜索鉴定了F. pseudograminearum中的3个短Scaffold为线粒体基因组,总GC含量为34.6%,进一步分别比较它们的同种镰刀菌线粒体基因组时,发现这两株内生镰刀菌线粒体基因组都显示出大于98%的序列同源性 (Kulik et al., 2020)。
  5. 通过结合de novo注释和基于同源的预测结果进行蛋白质编码基因的结构注释 (Rigden, 2017) 。然后在MAKER软件的帮助下,将上诉两种方法预测得到的基因集整合成一个非冗余的、更加完整的基因集,同时通过手动整合得到最终的可靠基因集。然后借助于外源蛋白数据库(SwissProt、TrEMBL、KEGG、InterPro等)对基因集中的蛋白进行功能注释。 
    Maker(v2.31.9)基因预测使用的主要参数:
    genome=F. culmorum.FASTA #基因组序列((FASTA文件或嵌入GFF3文件的FASTA))
    organism_type=eukaryotic #真核生物
    snaphmm=#SNAP HMM 文件
    gmhmm= #GeneMark HMM 文件
    augustus_species= #Augustus基因预测物种模型
    fgenesh_par_file= #FGENESH参数文件
    pred_gff= #GFF3的从头计算预测文件
    est2genome=0 #禁止从EST进行基因预测
    (Maker利用现有的软件工具(其中一些是基因预测)并对其输出进行集成,以根据证据比对得出给定位置的Maker认为是最佳可能的基因模型,上面用到的软件参数均为默认参数。)
  6. 使用BUSCO (Benchmark Universal Single-Copy Orologs) Fungi odb10数据库 (v.4.0.6) 对基因注释和基因组组装质量进行评估,结果显示Class2-1B和Class2-1C的基因注释和基因组组装质量分别为98.8%和99.1% (总共搜索了758个保守核心蛋白) ,这表明俩个基因组的组装质量是非常高的 (Simão et al., 2015)。使用Busco软件评估时使用的为默认参数,仅依据是蛋白质的评估/基因组评估调整“-mode =prot/genome #蛋白质或者基因组”。使用的busco库为fungi odb10。
  7. 重复序列是基因组的重要组成部分,主要包括两大类:分别为串联重复序列(Tandem repeat)和散在重复序列(Interpersed repeat)。其中串联重复序列包括有微卫星序列,小卫星序列等等;散在重复序列又称转座子元件,包括以DNA-DNA方式转座的DNA转座子和反转录转座子(retrotransposon)。对于转座子 (TEs) 注释,RepeatMasker (v.4.07) 用于Repbase数据库 (v.23.06) (Bao et al.,2015) 来识别已知的TEs。同时,还使用RepeatModeler (v1.0.11) 和LTR finder (Jurka et al,2005) 进行从头检测。在Class2-1B和Class2-1C中分别鉴定出约1.55Mb和2.04Mb的TEs (占总基因组的4.13%和5.37%) 。
    RepeatMasker主要参数:
    -nolow #不会掩盖低复杂度的DNA或简单的重复序列
    -no_is #跳过细菌插入元素检验
    –norna #不掩盖小RNA(伪)基因
    -parallel 1 #并行使用1个处理器(仅适用于批处理超过50 kb的文件或序列)

    RepeatModeler主要参数:默认。

    LTR finder主要参数:
    -w 2 #输出格式为表格
    -s LTR_FINDER.x86_64-1.0.5/tRNAdb/Sc-tRNAs.fa#使用指定RNA数据库(名称)

结果分析

一、组装结果

  1. 基因组评估
    在基因组组装前,为了用测序所得的read信息估计基因组特征,我们使用二代测序数据基于K-mer的分析方法来估计基因组大小和杂合率等基本信息。
    在本项目的分析当中,我们取K为17来进行分析,两个物种分析结果如下:


    图3 Fusarium culmorum Kmer分布图


    图4 Fusarium pseudograminearum Kmer分布图

    注:图中横坐标为深度(depth),纵坐标为各深度下的K-mer种类占所有K-mer种类的比例。

    从以上的结果可以看到两个物种的Kmer分布图均只有一个峰,说明这两个物种的杂合度都很低。根据kemer分析结果,预估的基因组大小: F. culmorum为40,053,289 bp,F. pseudograminearum为42,895,120 bp。
  2. 基因组特征 
    两株内生镰刀菌(F. culmorumF.pseudograminearum)的基因组测序后分别得到6和7个Scaffold,组装的总基因组大小为40.05 Mb和42.90 Mb,其中黄色镰刀菌被组装成4条染色体,2条为端粒对端粒,2条为有一端为端粒结构;假禾谷镰刀菌也被组装成4条染色体,3条为端粒对端粒,1条为有一端为端粒结构;N50 Scaffold长度分别为9.63 Mb和9.15 Mb;GC含量分别为47.4和47%;转座子大小分别为1.5Mb和2.04 Mb;黄色镰刀菌中的2个短Scaffold为线粒体基因组,大小为136406 bp;假禾谷镰刀菌中的3个短Scaffold为线粒体基因组,大小为136045 bp。

    表1. 黄色镰刀菌和假禾谷镰刀菌的基因组特点和预测特征



二、注释结果

    通过结合de novo注释和基于同源的预测结果进行蛋白质编码基因的结构注释。 使用Maker (v.2.31.9) 分别在F. culmorumF. pseudograminearum中预测了11,450和11,221个完整的蛋白编码基因模型。发现F. culmorumF. pseudograminearum中分别有97.06%和96.93%的基因可以在InterProScan、Gene Ontology、KEGG以及NR数据库被注释(见表2)。 在F. culmorumF. pseudograminearum中分别鉴定出总的重复序列为1572977 bp和2060381 bp,占总基因组的4.18%和5.43%。 其中鉴定出TEs约为1.55 Mb和2.04 Mb (占总基因组的4.13%和5.38%);串联重复分别鉴定出1.95 Mb和2.33 Mb,占总基因组的5%和6%(见表3和表4)。


    表2 F. culmorum和F. pseudograminearum基因组功能注释统计结果


    表3 F. culmorum重复序列分类结果统计


    表4 F. pseudograminearum重复序列分类结果统计


    致谢

    本protocol的研究工作得到课题“内生镰刀菌促进树木生长和耐盐性的分子调控机制研究”资助经费,课题编号为76B2018001。

    参考文献

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Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:单晓亮, 袁志林. (2021). 内生镰刀菌基因组染色体级别组装和注释. Bio-101: e2003654. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003654.
How to cite: Shan, X. L. and Yuan, Z. L. (2021). Chromosome-Scale Genome Assembly and Annotation Method of Endophyte Fusarium . Bio-101: e2003654. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003654.
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