小麦相关微生物的野外采样与样品保存
Field Sampling and Sample Storage of Wheat-associated Microbiomes   

材料与试剂

1.  一次性无菌手套 (AMMEX, catalog number: TLFCMDSi42100)
2. 无菌滤纸
3. 密封袋
4. 标签
5. 氧化锆珠 (南京东晟美生物科技有限公司，Zirconia beads, 5mm)
6. 10 ml离心管 (biosharp, micro-centrifuge tube, catalog number: S-100-M)
7. 小麦植株
8. 液氮
9. 干冰
10. 无菌水
    

仪器设备

1. 铁锹
2. 剪刀
3. 铅笔
4. 记号笔
5. 空泡沫盒
6. 干冰箱 (装有干冰的泡沫箱)
7. 液氮罐 (南京天玮地络仪器设备有限公司，catalog number: LD25)
8. 毛刷 (VICO, catalog number: WK82215)
9. -40 °C冰箱 (Haier, catalog number: DW-40L508)
10. -80 °C超低温冰箱 (Thermo Fisher Scientific, model number: 907)
11. 高通量快速研磨机 (上海净信，JXFSTPRP系列全自动样品快速研磨仪)
    

实验步骤

1. 根据试验设计，用铁锹挖取整株小麦植株，尽可能地去除根系部分的大土块、杂草等；手拿剧烈抖动根系至几乎没有明显的土壤掉落即可。
2. 用干净的剪刀分离根、茎、叶等各个植株组织部分后，分别置于密封袋中，在密封袋的外部用记号笔标明样品名称、采样时间、试验处理等信息；同时用铅笔写好标签，将标签贴于样品袋内部偏上部分，以防止外部记号笔标识在贮存时的模糊和损坏。
3. 将样品密封袋中的空气尽可能的排出，封口，再置于泡沫盒中，倒液氮速冻样品3-5 min。
4. 将速冻好的样品放置在-80 °C的干冰箱中，运回实验室。
5. 实验室中利用小毛刷 (提前灭菌) 将紧密附着在根系表面的土壤刷下来，尽量刷到根系表面无明显的土壤颗粒 (土壤和根系颜色一般有明显差异，可以通过颜色来辨别是否刷得较为干净了)， 收集到10 ml无菌离心管中，保存为小麦根际土样品。
6. 将剩余小麦根系用无菌水冲洗干净，利用无菌滤纸吸取洗净的根表多余水分，置于新的样品密封袋中，再用液氮速冻，保存为小麦根系样品。小麦的茎、叶等组织样品同根系样品的处理一样，即用无菌水冲洗干净后，用无菌滤纸吸取表面多余水分，置于新的密封袋中，液氮速冻保存。
7. 上述小麦根际土、根、茎、叶等样品袋封好口后，置于-40 °C 冰箱保存即可，若需长期保存，请置于-80 °C冰箱保存。
8. 后续取用测定小麦相关微生物时，将冷冻的小麦根、茎、叶等组织剪碎后，置于10 ml无菌离心管中，同时放入3-4粒5 mm氧化锆珠，在离心管表面写好样品标识。
9. 提前将研磨机适配器放入液氮中预冷，再将准备好的离心管置于适配器中进行研磨，将其中的小麦组织样品粉碎成粉末状，用以提取样品DNA；参数组设定：研磨次数1次，频率40 Hz，运行时间60 s。
   

注意事项

1. 所有野外和实验室对样品的操作，都需戴上一次性无菌手套进行处理，处理不同实验处理的样品时，请更换新的无菌手套。
2. 野外样品分离好后放入密封袋时，尽量排出密封袋里的空气后再封口，以防速冻时密封袋爆裂。
3. 如果需要测定小麦内生微生物，则需要在剪碎样品前，对小麦的根、茎、叶等组织进行表面消毒处理，以去除表面微生物。
4. 研磨时，注意每个离心管中放置的样品不要超过管的一半，不要按压的太紧，以防无法将样品充分研磨成粉末状；因此，建议每个样品研磨2-4管，再将这些管中的样品粉末混合到一个管中，以保持研磨后充足的样品份量。
5. 研磨前液氮冷冻样品即可，不要将离心管放入液氮中冷冻，否则研磨时，离心管底部容易破裂。
   

溶液配方

1. 无菌水
   去离子水进行高压灭菌
   

致谢

本实验得到国家自然科学基金项目 (31870480) 的资助。

参考文献

1. Zimmerman, N. B. and Vitousek, P. M. (2012).Fungal endophyte communities reflect environmental structuring across a Hawaiian landscape. P Natl Acad Sci USA 109: 13022-13027.
2. Fan, K., Delgado-Baquerizo, M., Zhu, Y. and Chu, H. (2020). Crop production correlates with soil multitrophic communities at the large spatial scale.Soil Biol Biochem 151: 108047.