猪胃肠道内容物和黏膜样品采集与微生物组成分析
The Collection of Gastrointestinal Content and Mucosa from Pigs for the Analysis of Microbial Community   

材料与试剂

1. 各种型号 (10 μl, 200 μl, 1000 μl) 移液枪头
2. 离心管 (EP管，1.5 ml/2 ml)
3. 一次性无菌手套
4. 灭菌药勺
5. 75% 酒精棉球
6. 灭菌载玻片
7. 灭菌吸水滤纸
8. PCR用8联管
9. Tris-HCl
10. 95%和70%乙醇
11. RNA酶 (天根生化科技有限公司)
12. 细菌、古菌、真菌通用PCR引物
13. Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix (Thermo Scientific公司)
14. 琼脂糖 (西班牙Biowest公司)
15. GeneJET 胶回收试剂盒 (Thermo Scientific公司)
16. Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建库试剂盒 (Thermofisher 公司)
17. 苯酚-氯仿-异戊醇溶液 (体积比：25:24:1)
18. CATB buffer (溶液配方)
19. TE buffer (见溶液配方)
20. 3 M醋酸钠 (NaAc) 溶液 (见溶液配方)
21. TAE缓冲液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 涡旋仪
2. 离心机 (Thermo Scientific Sorvall Legend Micro 21R 微量离心机)
3. PCR仪 (Bio-rad T 100梯度 PCR仪)
4. 恒温水浴锅
5. 移液枪
6. MP研磨仪 (美国MP Biomedicals FastPrep-24 5G)
7. NanoDrop 2000超微量分光光度计 (Thermo Scientific)
8. Bio-rad ChemiDoc XRS凝胶成像系统
9. Dark reader荧光投射切胶仪
10. 制胶槽
11. Thermofisher IonS5TMXL 测序平台
    

实验步骤

1. 猪胃肠道内容物采集
   
   1.1

   在动物试验结束时，通过前腿肩胛骨以上的位置或者耳根后3 cm的位置注射戊巴比妥钠 (59 mg/kg体重) 麻醉并处死试验猪。
   1.2

   固定：所有手术器械提前用75%酒精浸泡消毒。猪处死后，首先切断肩胛骨内侧和髋关节周围肌肉，将四肢向外侧摊开，仅以皮肤将四肢与躯干相连，以固定尸体为仰卧位。
   1.3

   开腹：从剑状软骨后方沿腹壁正中线由前向后至耻骨联合处切开腹壁，再从剑状软骨沿左右两侧肋骨后缘切开至腰椎横突，使腹壁被分为大小相等的两楔形，将其向两侧分开。
   1.4

   分离肠道：将小肠移向左侧，以暴露直肠，在骨盆腔中单结扎。切断直肠，左手握住直肠断端，右手持刀，从前往膈部方向割断肠系膜根部等各种联系，至膈时，在胃贲门前端单结扎并剪断食管，取出全部胃肠道。再按胃、十二脂肠、空肠、回肠、盲肠、结肠等不同肠段分别进行两端结扎并分离各段消化道。
   1.5

   将分离好的各段消化道置于灭菌锡箔纸上，用灭菌医用剪刀将胃和各肠段中部剪开一个小口，再用灭菌药勺挖取大约2 g内容物分装到已灭菌的2 ml冻存管中，旋紧螺盖后迅速放入液氮或-80 °C超低温冰箱中保存待用。
2. 猪胃肠道黏膜采集
   
   2.1-2.4 同上述1.1-1.4步骤
   2.5

   将分离好的各段消化道置于灭菌锡箔纸上，用灭菌医用剪刀将胃壁裁剪约8 cm²，十二指肠截取约10 cm，其他各肠段截取约20 cm，用无菌生理盐水将上述组织内壁轻轻冲洗干净，至内壁没有肉眼可见的粘附内容物为止。之后，将除胃以外的各肠段沿中线纵向剪开，再用灭菌载玻片轻柔刮取胃/肠内壁，载玻片与组织的角度约为45°，将刮下的黏膜分装到灭菌后的2 ml EP管中，迅速放入液氮或-80 °C超低温冰箱中保存待用。
3. 食糜和黏膜基因组DNA的提取
   
   3.1

   取出样品后，放置在冰上解冻。
   3.2

   在灭菌后的2 ml螺口离心管中加入300 mg锆珠，称取约0.3 g内容物/黏膜加入管中，再加入900 μl 70 °C预热的CTAB buffer，旋紧螺口，置于MP研磨仪，选择faeces/Mucosa程序 (程序包含：beats 1 min，室温静置1 min；上述步骤重复3次)。
   3.3

   将研磨后的螺口离心管置于恒温水浴锅中70 °C孵育20 min，后取出，以9,300 × g 离心10 min。
   3.4

   吸取上清700-850 μl，加入3-5 μl RNA酶 (10 mg/ml)，37 °C水浴孵育15-30 min。
   3.5

   加入700 μl配制好的酚-氯仿-异戊醇溶液，使用涡旋仪震荡40 s以充分混匀。
   3.6

   充分混匀后离心 (15,700 × g, 10 min, 4 °C)，取上清600-750 μl至新的1.5 ml EP管中。
   3.7

   加入600 μl酚-氯仿-异戊醇，震荡40 s，充分混匀后离心 (15,700 × g, 10 min, 4 °C)，取上清500-600 μl至新的1.5 ml EP管中。
   3.8

   加入800 μl 95%的冰乙醇和3 M的醋酸钠溶液40 μl，放-20 °C冰箱中过夜。
   3.9

   过夜后，取出离心 (15,700 × g, 20 min, 4 °C)，再弃上清，后加入500 μl 70%的冰乙醇，轻轻弹起沉淀。
   3.10

   离心 (15700 × g, 5 min，4 °C)，再弃上清，后倒置于干净吸水纸上自然干燥2 h左右，直至管内壁没有肉眼可见的水珠为止。
   3.11

   加入50-100 μl TE buffer，涡旋混匀30 s，之后70 °C水浴孵育5 min。
   3.12

   用NanoDrop 2000测定DNA的浓度和纯度，并用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，将制备好的DNA溶液保存于-80 °C备用。
4. 扩增子文库构建和序列分析
   
   4.1

   模板DNA的制备：取适量DNA样品于离心管中，使用灭菌双蒸水稀释样品至1 ng/μl，作为模板。
   4.2

   引物：使用带Barcode的通用引物扩增得到相应的PCR产物。其中，细菌的扩增可采用针对16S rRNA V3-V4区的通用引物343F-806R (5'-TACGGRAGGCAGCAG-3'和5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') (Itoh et al., 2014)；古菌的扩增可采用通用引物341F-806R (5'-CCTAYGGGRBGCASCA G-3'和5'-GGACTACHVGGGTWTCAAT-3') (FRANK et al., 2013)；真菌的扩增可采用ITS rDNA通用引物ITS1-ITS4(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' 和5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3') (White et al., 1990)。
   4.3

   反应体系和扩增程序：使用New England Biolabs公司的Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer。使用高效和高保真的酶进行PCR， 确保扩增效率和准确性。PCR反应体系 (30 μl) 包括：Phusion Master Mix (2×) 15 μl、上下游引物 (2 μM) 各3 μl、基因组DNA (1 ng/μl) 10 μl、灭菌 双蒸水 (2 μl)
   

   1)

   细菌序列扩增反应程序 (Itoh et al., 2014)：94 °C预变性5 min；95 °C 30 s、56 °C 30 s、68 °C 45 s共35个循环；68 °C延伸5 min。

   2)

   古菌序列扩增反应程序 (FRANK et al., 2013)：94 °C预变性3 min；94 °C 30 s、50 °C 30 s、72 °C 30s共30个循环；72 °C延伸5 min。

   3)

   真菌序列扩增反应程序 (White et al., 1990)：94 °C预变性 5 min；94 °C 1 min、55 °C 1 min、72 °C 1.5 min共35个循环；72 °C延伸10 min。
   使用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测上述PCR产物，采用NanoDrop 2000 测定产物浓度。
   4.4

   PCR产物的混合、纯化：根据PCR产物浓度进行等质量混样，充分混匀后使用2%琼脂糖凝胶电泳 (1× TAE buffer) 对PCR 产物进行浓缩，割胶回收目标条带，采用GeneJET胶回收试剂盒 (Thermo Scientific) 对PCR产物进行纯化。
   4.5

   文库构建和测序：使用Thermofisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit定量和文库检测合格后，使用IonS5TMXL测序平台单端测序 (Single-End) 法进行上机测序。
   4.6

   信息分析流程：采用Cutadapt软件 (V1.9.1, http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/) (Bolger et al., 2014) 去除低质量、Barcode和引物序列后得到原始数据 (Raw reads)。原始数据再进行质控过滤，得到有效数据 (Clean Data)。以序列相似度97%为标准，从原始数据到OTU表主要采用UPARSE v10.0 (Edgar, 2013) 软件对所有有效序列进行可操作分类单元 (Operational taxonomic unit, OTU) 聚类分析。采用UCHIME (Edgar et al., 2011) 检测并去除PCR扩增过程产生的嵌合体，采用Usearch_global方法分析各OTU丰度。之后，与参考数据库 (细菌和古菌可参考Greengenes或SLIVA数据库，真菌可参考UNITE数据库) 进行比对，采用QIIME软件 (http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html) 及RDP Classifier贝叶斯算法 (Version 2.2, http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/) 对每个OTU中的所有序列进行分析和注释，在各分类水平统计样品的微生物群落组成。最后，在以上分析的基础上，可以进行基于OTUs和物种组成的聚类分析。用QIIME软件计算样品的α-多样性指数 (Shannon指数、覆盖率、OTU数和Chao1指数) ，并基于UniFrac距离分析样品的β-多样性。用R软件 (Version 4.0.1) ade4、vegan、WGCNA、ggplot2等软件包进行PCA，PCoA、NMDS、CCA和RAD分析，挖掘物种的组间差异，并结合环境因素 (如日粮结构、营养素、生产表型、健康表型、微生物代谢产物浓度等) 进行关联分析，并对结果进行可视化。

注意事项

1. 在采集胃肠道内容物和黏膜的过程中，分离各段消化道时，锡箔纸下方须垫冰袋，以保证采样过程的低温。
2. 采集各肠段内容物或黏膜时，每头猪须尽量在同一位点进行取样，以最大程度降低取样部位不同带来的误差，可用标尺对取样位点进行准确定位。
3. 刮取肠道黏膜时力道尽量轻柔、均匀，不能刮破胃肠壁；一般对每头猪而言，肠黏膜样品装至一支2 ml冻存管的3/4满即可，视具体情况酌量增、减。
4. 无论采集内容物或黏膜样本，一次性手套、采集勺或载玻片均应“一猪一换”和“一部位一换”，切不可混用造成样品污染。
5. 采样过程注意无菌操作，采样人员需严格佩戴口罩；采样房间应提前用紫外灯照射1 h；操作台应事先采用75%酒精喷洒消毒。
6. 在DNA提取过程中，如果样品研磨后非常黏稠，可吸取部分糊状物到新的锆珠管中，再加入700 μl CTAB buffer，混匀后70 °C孵育，再重复之前的步骤。
7. 用于PCR扩增的所有试剂均应事先置于冰上融化，用完后及时放回-20 °C冰箱保存。
8. 进行PCR扩增时为了保证数据的可靠性，需要设置阴性对照 (不加DNA模板，以同体积的灭菌双蒸水替代) 和阳性对照 (如单一菌株的DNA)。
9. 在进行PCR扩增前，模板必须进行纯化，以及引物序列必须进行优化，以保证PCR反应的专一性。
10. 实验过程中所使用的各类耗材必须经过灭菌处理。
    

溶液配方

1. CTAB buffer
   CTAB (北京博奥拓达科技有限公司) 4 g, NaCl 16.364 g, 1 M的Tris-HCl 20 ml (pH 8.0)，0.5 M的EDTA溶液8 ml，先用70 ml去离子水溶解，再定容至200 ml, 121 °C，20 min高压灭菌后，待用。
2. TE buffer
   首先用900 ml的去离子水溶解1.576 g 的Tris-HCl；加2 ml 0.5 M的EDTA (pH 8.0)；调整pH至7.6；用去离子水定容至1.0 L, 121 °C，20 min高压灭菌后， 待用。
3. TAE buffer
   
   3.1

   50× TAE buffer的配制
   称取242 g的Tris、37.2 g的Na₂EDTA·2H₂O至1 L螺口 (广口) 玻璃瓶， 加入800 ml的去离子水，充分搅拌溶解，加入57.1 ml冰醋酸，上下颠倒 混匀。加去离子水定容至1.0 L，室温保存。
   3.2

   1× TAE buffer的制备
   使用时，用双蒸水将提前配制好的50× TAE buffer稀释为1× TAE buffer。 例如，使用10 L的带嘴塑料壶，倒入200 ml 50× TAE，再用双蒸水定容至10.0 L，混匀备用。
4. 3 M的醋酸钠溶液
   将408.1 g的NaAc·3H₂O溶于800 ml去离子水中。用冰醋酸将pH调至5.2 后。加入去离子水定容至总体积为1.0 L。121 °C, 20min高压灭菌后，待用。
   

致谢

本工作受国家自然科学基金 (31872369、32072743) 和四川农业大学双支计划项目资助，特致感谢！目前已应用本实验方案发表文章30余篇，部分如下：

1. 罗玉衡, 陈洪, 余冰, 何军, 黄志清, 毛湘冰, 郑萍, 虞洁, 罗钧秋, 陈代文. (2017). 短期或长期饲喂高水平豌豆纤维对猪盲肠微生物群落结构和代谢产物的影响. 畜牧兽医学报 48(8):1459-1467.
2. 张玲, 罗玉衡, 陈代文, 余冰, 何军, 虞洁, 罗钧秋, 毛湘冰, 黄志清, 郑萍, 罗玉衡. (2017). 饲粮中短期内单独及混合添加高水平燕麦β-葡聚糖和微晶纤维素对小鼠生长性能、器官指数和粪便细菌群落结构的影响. 动物营养学报29(007): 2407-2415.
3. Li, J. Y., Chen, D. W., Luo, Y. H., He, J., Huang, Z. Q., Mao, X. B., Zheng, P., Yu, J., Luo, J. Q., Tian, G. and Luo, Y. H. (2020). The fungal community and its interaction with the concentration of short‐chain fatty acids in the faeces of Chenghua, Yorkshire and Tibetan pigs. Microb Biotechnol 13(2): 509-521.
4. Li, J. Y., Luo, Y. H., Chen, D. W., Yu, B., He, J., Huang, Z. Q., Mao, X. B., Zheng, P., Yu, J., Luo, J. Q., Tian, G., Yan, H., Wang, Q. Y. and Wang, H. F. (2020). The fungal community and its interaction with the concentration of short‐chain fatty acids in the caecum and colon of weaned piglets. J Anim Physiol Anim Nutr 104(2): 616-628.
5. Luo, Y. H., G Wright, A. D., Li, Y. L., Li, H., Yang, Q. H., Luo, L. J. and Yang, M. X. (2013). Diversity of methanogens in the hindgut of captive white rhinoceroses, Ceratotherium simum. BMC Microbiol 13:207.
6. Luo, Y. H., Yang, C., G Wright, A. D., He, J. and Chen, D. W. (2015). Responses in ileal and cecal bacteria to low and high amylose/amylopectin ratio diets in growing pigs. Appl Microbiol Biotechnol 99:10627-10638.
7. Luo, Y. H., Zhang, L., Li, H., Smidt, H., G Wright, A. D., Zhang, K. Y., Ding, X. M., Zeng, Q. F., Bai, S. P., Wang, J. P., Li, J., Zheng, P., Tian, G., Cai, J. Y. and Chen, D. W. (2017). Different types of dietary fibers trigger specific alterations in composition and predicted functions of colonic bacterial communities in BALB/c mice. Front Microbiol 8: 966.

参考文献

1. Bolger, A., Lohse, M. and Usadel, B. (2014). Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics 30: 2114–20.
2. Edgar, R. C. (2013). UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nat methods 10: 996-998.
3. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C. and Knight, R. (2011). UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics 27(16): 2194-2200.
4. Frank, K. L., Rogers, D. R., Olins, H. C., Vidoudez, C. and Girguis, P. R. (2013). Characterizing the distribution and rates of microbial sulfate reduction at middle valley hydrothermal vents. ISME J 7(7): 1391-1401.
5. Itoh, H., Navarro, R., Takeshita, K., Tago, K., Hayatsu, M., Hori, T. and Kikuchi, Y. (2014). Bacterial population succession and adaptation affected by insecticide application and soil spraying history. Front Microbiol 5: 457.
6. White, T. J., Bruns, T., Lee, S. and Taylor, J.W. (1990). Chap. 1: Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J. and White, T. J. (Eds.). In: PCR Protocols. Academic Press, Inc., 315-322.