摘要:黄翅大白蚁是广泛分布于中国南部的一种主要高等培菌白蚁。本文介绍以几丁质为碳源从黄翅大白蚁后肠分离获得几丁质降解菌株的方法。
关键词: 培菌白蚁, 黄翅大白蚁, 肠道微生物, 几丁质降解
背景
白蚁肠道中存在多种共生微生物,包括细菌、真菌和原生动物如鞭毛虫,根据白蚁后肠有无鞭毛虫,可将白蚁分为低等白蚁 (有) 和高等白蚁 (无) 两大类 (Ni et al., 2013)。高等白蚁根据食性又分为食木/草白蚁、食土/腐殖质白蚁和培菌白蚁。培菌白蚁属于白蚁科大白蚁亚科,其在蚁巢中专一培养真菌鸡枞菌(Termitomyces) (Aanen et al.,2009),两者存在共生互惠关系。白蚁取食鸡枞菌的无性孢子—小白球菌(Termitosphaeria duthiei (Berk.) Ciferri.),获得必需的氮源,而小白球菌在白蚁肠道与木质颗粒混合,经过消化后被排泄到体外形成新的菌圃 (Poulsen,2015)。真菌细胞壁主要由几丁质、葡聚糖和蛋白质组成,因此几丁质代谢是培菌白蚁营养利用以及抑制菌圃上其它杂菌生长的关键环节。通过分离培养能够降解几丁质的肠道微生物,为进一步研究培菌白蚁消化利用真菌和抵御杂菌在菌圃的生长奠定基础。
材料与试剂
仪器设备
软件和数据库
实验步骤
一、白蚁肠道几丁质降解菌的分离与纯化
二、白蚁肠道分离菌株的序列分析
结果与分析
一、分离到8株几丁质降解菌 稀释10-3倍数的后肠组织样品在几丁质培养基平板上,长出50个左右的菌落。筛选几丁质降解圈大的菌落,多次在几丁质培养基上划线纯化,最后获得纯培养菌株。纯菌株在几丁质培养基上培养5 d,若观察到明显的几丁质降解圈,表明筛选的纯菌株可产生几丁质酶。在有氧条件下分离到5个纯菌株,分别记为chi-1、chi-2、chi-3、chi-4和chi-5;在厌氧条件下分离到3个纯菌株,分别记为an-chi-1、an-chi-2和an-chi-3 (图1)。图 1. 8株几丁质降解菌的培养特征二、16S rRNA序列分析 纯化后的菌株,通过16SrRNA基因测序,然后对其序列进行比对分析,发现它们属于不同属的菌株。它们分别与Flavobacterium oceanosedimentum,Dactylosporan-gium salmoneum,Brevibacillus borstelensis,Sphingomonas koreensis,Paenibacillus odorifer,Cellulomonas flavigena,Stenotrophomonas panacihumi和Bacillus cereu 相似度最高,相似度均大于97% (表1)。其中黄杆菌属Flavobacterium、指孢囊菌属Dactylosporangium和纤维单胞菌属Cellulomonas属于放线菌菌门,鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas和寡养单胞菌属Stenotrophomonas属于变形菌门,短芽孢杆菌属Brevibacillus、类芽孢杆菌属Paenibacillus和芽孢杆菌属Bacillus属于厚壁菌门 (图2)。表1. 8 株几丁质降解菌16S rRNA 的序列在GenBank中的比对结果图2. 分离纯化的8株几丁质降解菌基于16S rRNA基因序列构建的进化树
注意事项
溶液配方
致谢
本项目获得国家重点基础研究发展计划 (973计划, 编号:2011CB707402),国家自然科学基金 (编号:31970119, 31272370, 30870085) 及山东大学微生物技术国家重点实验室自主设置课题的支持。依据本实验方案我们从培菌白蚁肠道中分离到几丁质降解菌,并发现鉴定到一个新菌种 (孙新新等,2017; Sun et al.,2018)。
参考文献
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