瘤胃混合细菌连续传代培养技术
Sequentially Transfer Ruminal Bacterial Cultures Technology in vitro   

材料与试剂

1. 各种型号枪头
2. 离心管 (2 ml, 15 ml, 50 ml)
3. 注射器 (1 ml)
4. CaCl₂·2H₂O (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
5. MnCl₂·4H₂O (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
6. CoCl₂·6H₂O (天津市科密欧化学试剂有限公司，中国，分析纯)
7. FeCl₃·6H₂O (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
8. NH₄HCO₃ (天津市科密欧化学试剂有限公司，中国，分析纯)
9. NaHCO₃ (上海苏懿化学试剂有限公司，中国，分析纯)
10. Na₂HPO₄ (天津市科密欧化学试剂有限公司，中国，分析纯)
11. KH₂PO₄ (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
12. MgSO₄·7H₂O (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
13. Na₂S·7H₂O (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
14. 刃天青 (Solarbio，北京)
15. 超纯水
16. 人工培养缓冲液
    

仪器设备

1. 锥形瓶 (500 ml)
2. 容量瓶 (1 L)
3. 量筒 (500 ml)
4. 螺口瓶 (1 L)
5. 胶塞 (Bellco Glass Inc.，20 mm，catalog number: 2048-11800A)
6. 厌氧培养瓶 (150 ml)
7. 恒温培养箱
8. 磁力搅拌器
9. 二氧化碳气罐及气体
10. 气压测定计 (CeComp Electronics Inc., catalog number: DPG1000B15PSIG-5)
    

实验步骤

一、矿物盐缓冲液的制备
根据矿物盐缓冲液 (配方见表1)，分别配制A、B、C液，按照400 ml蒸馏水 + 0.1 ml A液 + 200 ml B液 + 200 ml C液 + 1 ml 刃天青的比例混合各溶液，配制成矿物盐缓冲液，并持续通入无氧二氧化碳 (纯度：99.9 %以上)，控制气体流速，有连续气泡流出即可。加入磁力转子 (蒸馏水洗干净) 在磁力搅拌器上搅拌，通气约3 h (pH = 6.8 ± 0.1)。A、B、C液经灭菌后可保存1个月 (4 °C)，若不灭菌，则现用现配。

二、发酵底物准备
将发酵底物 (如植物性饲料) 经65 °C干燥48 h后，粉碎过40目筛 (0.42 mm粒径)，密封备用。实验使用150 ml体积的厌氧培养瓶为培养装置，采集牛/羊瘤胃液 (瘤胃液采集时间可根据试验目的来确定) 前用小药勺称取发酵底物于干燥培养瓶中。为了保证测试样品具有代表性，每个样品至少做6个平行测定。

三、接种 (林淼等， 2020)
每只培养瓶加入15 ml缓冲液，并持续通入CO2 (纯度：99.9 %) 5 min，加入2.5 %硫化钠溶液0.15 ml后，胶塞密封，光照至缓冲液内的刃天青由蓝到粉直到褪至无色。瘤胃液来自带有永久性瘤胃瘘管的牛或羊，经4层无菌纱布过滤后，将容器灌满，立刻于39 °C水浴并迅速带回实验室。每瓶加入2 ml瘤胃液，胶塞密封加铝盖后，测初始气压值。将培养瓶于39 °C静置培养。

四、传代
每72 h (根据实验目的可调整) 传代一次，传代量为2 ml，其操作同''三、接种"。具体培养代数可根据试验目的选择。在每次传代后和72 h培养结束时，测定气压和发酵液pH值。收集发酵混合液。如为了研究细菌量的差异，可以在传代前和培养过程中根据试验目的留样测定细菌量。

溶液配方

矿物盐培养缓冲液 (Menke et al., 1979) 配方见表1。

表1. 溶液配方


注：灭菌超纯水400 ml + A液0.1 ml + B液200 ml + C液200 ml + 刃天青溶液1 ml。配制A、B、C、刃天青、还原剂溶液的水需要无菌。使用前配制。

致谢

本研究得到了国家现代农业产业技术体系 (CARS-36)，江苏省高校优势学科建设自主工程项目资助。Lin, M., Dai, X. X. and Weimer, P. J. (2019). Shifts in fermentation end products and bacterial community composition in long-term, sequentially transferred in vitro ruminal enrichment cultures fed switchgrass with and without ethanol as a co-substrate. Bioresource Technol 285: 121324.

参考文献

1. 林淼，王阔鹏，陈映良，孙文婧，封丽梅，胡梓轩. (2020). 乙醇对瘤胃液接种稻秸的体外发酵产物及细菌群落结构的影响. 生物技术通报 36(2): 91-99.
2. Menke, K. H., Raab, L., Salewski, A. and Schneider, W. (1979). The estimation of the digestibility and metabolizable energy content of ruminant feedingstuffs from the gas production when they are incubated with rumen liquor in vitro. J Agr Sci 93(1): 217-222.