摘要:金属硫化物矿山具有pH值低、重金属含量高等特点,为通过氧化亚铁和无机硫获取能量的冶金微生物提供了独特的寡营养生态位,其中嗜酸硫杆菌属(Acidithiobacillus)内不同种具有不同的铁硫氧化功能,是酸性矿山环境及冶金过程的代表性优势属。16S rRNA扩增子测序是研究微生物群落组成及多样性的重要手段,但无法根据测序结果对Acidithiobacillus在种水平上加以区分。实时荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)因特异性好,灵敏度高,已成为现今物种定量分析的主流技术之一。为准确刻画浸矿过程中硫化矿物表面具有不同铁硫氧化功能的冶金微生物群落组成规律,本文将16S rRNA测序与RT-qPCR技术相结合,提出了一种高效精确的冶金微生物群落结构分析方法,能够在种水平区分高丰度的铁硫氧化功能类群,对研究微生物群落氧化硫化矿物的过程机理以及指导工业菌群的优化调控具有重要意义。
关键词: 酸性矿山, 矿物表面, 微生物, 16S rRNA测序, RT-qPCR
材料与试剂
- 50 ml离心管(Corning,catalog number: 352070)
- 10 ml离心管(CNWTC,catalog number: TYA04)
- 5 ml离心管(Eppendorf,catalog number: 0030119401)
- 1.5 ml尖底离心管(Fisher Scientific,catalog number: 05-408-129)
- 各种型号枪头(20 µl,200 µl,1 ml)
- 0.2 mm玻璃珠
- 2×SYBR Green qPCR Master Mix核酸染料
- 96孔PCR板(Axygen,PCR-96-FLT-C)
- (NH4)2SO4
- K2HPO4
- KCl
- Ca(NO3)2
- MgSO4·7H2O
- 乙醇(96%-100%)
- 琼脂糖
- TBE缓冲液(0.5x)
- 双链DNA高灵敏度荧光定量试剂盒(Invitrogen,catalog number: Q32851)
- TIANamp® Bacteria DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech,catalog number: DP302),含有以下组分:
- 溶菌酶缓冲液(20 mM Tris,pH 8.0;2 mM Na2EDTA;1.2% Triton;终浓度为20 mg/ml的溶菌酶)
- 9K培养基(见溶液配方)
- 琼脂糖凝胶(见溶液配方)
仪器设备
- 烧杯
- 移液枪
- 分析天平
- 高速离心机
- 光学显微镜
- 涡旋混合器
- 电泳仪
- NanoDrop-1000微量分光光度计
- Qubit 2.0核酸蛋白定量仪
- Illumina Miseq测序平台
- Veriti 96-well Fast Thermal Cycler梯度PCR仪 (Thermo Fisher,model: 4375786)
- Bio-rad iCycler iQ实时定量PCR监测系统
实验步骤
- 矿物表面微生物收集
- DNA提取
使用TIANamp® Bacteria DNA提取试剂盒进行DNA的提取,具体步骤如下:
- 群落组成分析
结果与分析
- 通过1.0%(w/v)琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop-1000微量分光光度计检测矿物表面微生物DNA提取质量,并利用双链DNA高灵敏度荧光定量试剂盒在Qubit 2.0核酸蛋白定量仪上测定DNA浓度。
- 16S rRNA基因测序技术为微生物群落的组成及多样性研究提供了强有力的工具,能够识别已知和未知物种,但通常只能鉴定至属水平(Lukhele et al., 2019)。据报道,酸性矿山环境物种多样性相对较低,代表性优势类群约占微生物总量的90%,如既能氧化亚铁又能氧化硫的嗜酸硫杆菌属(Acidithiobacillus)和硫化杆菌属(Sulfobacillus),仅能氧化亚铁的钩端螺旋菌属(Leptospirillum)和铁质菌属(Ferroplasma)。其中,Acidithiobacillus是广泛存在于AMD环境的典型类群,该属中嗜酸氧化亚铁硫杆菌(A. ferrooxidans)和耐冷嗜酸硫杆菌(A. ferrivorans)能够氧化亚铁和硫获取能量,而嗜酸氧化硫硫杆菌(A. thiooxidans)和嗜酸性喜温硫杆菌(A. caldus)仅能够通过氧化矿物中的硫获得能量维持自身代谢(Chen et al., 2015; Méndez-Garcíaet et al., 2015)。RT-qPCR虽无法挖掘未知物种信息,但能够对已知物种进行精确定量。
表2. 铁硫富集群落在黄铜矿浸出过程中优势属相对丰度
- 在分别利用富铁少硫能源底物和富硫少铁能源底物驯化菌群(分别命名为Fe-O和S-O)进行黄铜矿浸出实验中,16S rRNA高通量测序结果表明,在各组中Acidithiobacillus均为绝对优势属(>60%),在Fe-O群落浸出初期占比甚至高达99%(表2),但铁氧化菌或硫氧化菌在群落中的占比并不清楚。基于RT-qPCR精确定量结果,获得A. ferrooxidans、A. ferrivorans、A. thiooxidans和A. caldus的扩增比例,带入16S rRNA测序结果中Acidithiobacillus的相对丰度,计算属内四个优势种在整个样本中的相对量,并将微生物群落组成以柱形图展示。如图1所示,Acidithiobacillus属内不同铁硫氧化功能类群的相对丰度得以明确,在铁富集浸出体系中,A. ferrooxidans和A. caldus为优势种,分别占30%-45%和30%-65%;而A. thiooxidans和A. ferrooxidans在硫富集浸出体系中占据主导地位,相对丰度分别约为50%和20%。因此,在16S rRNA测序的基础上,联合RT-qPCR技术精确定量Acidithiobacillus属的不同功能类群,能够更加全面揭示浸出过程中群落组成及演替规律,为冶金微生物的浸出行为及机理研究奠定基础。(Ma et al., 2018; Tao et al., 2018)。
图1. 铁硫富集群落在黄铜矿浸出过程中群落演替规律
溶液配方
- 9K培养基
(NH4)2SO4
| 3 g
|
K2HPO4
| 0.5 g
|
KCl
| 0.1 g
|
Ca(NO3)2
| 0.01 g
|
MgSO4·7H2O
| 0.5 g
|
溶于1 L蒸馏水中
- 琼脂糖凝胶(1%)
致谢
本工作的顺利开展得益于国家自然科学基金项目(资助号:42007306和31570113)和中南大学生物冶金教育部重点实验室基金(资助号:MOEKLB1702)的支持。
参考文献
- Chen, L. X., Hu, M., Huang, L. N., Hua, Z. S., Kuang, J. L., Li, S. J. and Shu, W. S. (2015). Comparative metagenomic and metatranscriptomic analyses of microbial communities in acid mine drainage. ISME J 9(7): 1579-1592.
- Lukhele, T., Selvarajan, R., Nyoni, H., Mamba, B. B. and Msagati, T. A. M. (2019). Diversity and functional profile of bacterial communities at Lancaster acid mine drainage dam, South Africa as revealed by 16S rRNA gene high-throughput sequencing analysis. Extremophiles 23(6): 719-734.
- Ma, L., Wang, X., Feng, X., Liang, Y., Xiao, Y., Hao, X., Yin, H., Liu, H. and Liu, X. (2017a). Co-culture microorganisms with different initial proportions reveal the mechanism of chalcopyrite bioleaching coupling with microbial community succession. Bioresour Technol 223: 121-130.
- Ma, L., Wang, X., Tao, J., Feng, X., Zou, K., Xiao, Y., Liang, Y., Yin, H. and Liu, X. (2017b). Bioleaching of the mixed oxide-sulfide copper ore by artificial indigenous and exogenous microbial community. Hydrometallurgy 169: 41-46.
- Ma, L., Wang, X., Liu, X., Wang, S. and Wang, H. (2018). Intensified bioleaching of chalcopyrite by communities with enriched ferrous or sulfur oxidizers. Bioresour Technol 268: 415-423.
- Méndez-García, C., Peláez, A. I., Mesa, V., Sánchez, J., Golyshina, O. V. and Ferrer, M. (2015). Microbial diversity and metabolic networks in acid mine drainage habitats. Front Microbiol 6: 475.
- Tao, J., Qin, C., Feng, X., Ma, L., Liu, X., Yin, H., Liang, Y., Liu, H., Huang, C., Zhang, Z., Xiao, N. and Meng, D. (2018). Traits of exogenous species and indigenous community contribute to the species colonization and community succession. Front Microbiol 9: 3087.
- Wang, X., Ma, L., Wu, J., Xiao, Y., Tao, J. and Liu, X. (2020). Effective bioleaching of low-grade copper ores: Insights from microbial cross experiments. Bioresour Technol 308: 123273.
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:黄珊珊, 马丽媛, 刘学端. (2021). 基于16S rRNA测序和RT-qPCR的硫化矿物表面微生物群落组成分析. // 微生物组实验手册.
Bio-101: e2003690. DOI:
10.21769/BioProtoc.2003690.
How to cite: Huang, S. S., Ma, L. Y. and Liu, X. D. (2021). Analysis of Microbial Community Composition on Sulfide Mineral Surface Based on 16S rRNA Sequencing and RT-qPCR. // Microbiome Protocols eBook.
Bio-101: e2003690. DOI:
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