基于PacBio SMRT三代测序的红树林沉积物真菌群落的研究
Analysis of Fungal Community in Mangrove Sediments Based on PacBio SMRT Sequencing   

材料与试剂

1. DNeasy PowerSoil Kit (Qiagen, catalog number: 12888-50/12888-100) 或 FastDNA Spin Kit for soil (MP Biomedicals, catalog number: 116560)
2. PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (Takara, catalog number: R050) 或 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo Scientific, catalog number: F537L)
3. 无菌超纯水
   

仪器设备

1. 沉积物采样器
2. 涡旋振荡器 (带适配器) /组织研磨仪 (MP Biomedicals, MP Fastprep-24 5G)
3. NanoDrop ND-2000c UV-Vis spectrophotometer (NanoDrop Technologies)
4. ProFlex™ PCR仪 (ThermoFisher)
   

软件和数据库

一、软件

1. pbccs (v4.02, https://github.com/PacificBiosciences/ccs)
2. BAM2fastx (https://github.com/pacificbiosciences/bam2fastx/)
3. lima (v1.11.0, https://github.com/pacificbiosciences/barcoding/)
4. flexbar (v3.0, https://github.com/seqan/flexbar)
5. mothur (v1.44.2, https://github.com/mothur/mothur/releases/tag/v1.44.2)
6. vsearch (v2.15.0, https://github.com/torognes/vsearch/releases/)
7. ITSx (v1.0.11, https://microbiology.se/software/itsx/)
8. usearch (v10.0.240, https://drive5.com/usearch/)
9. BLAST+ (v2.10.1, https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/)
10. RAxML (v8.2.12, https://github.com/stamatak/standard-RAxML)
11. IQTree (v2.1.1, http://www.iqtree.org)
12. FastTree (v2.1.11, http://www.microbesonline.org/fasttree/)
    
    

二、数据库

1. UNITE (v8.2, https://doi.org/10.15156/BIO/786372) for ITS
2. Silva (release 138, https://www.arb-silva.de/documentation/) for 16S/18S rDNA
3. UCHIME reference dataset (v7.2, https://unite.ut.ee/repository.php)

实验步骤

一、样品采集与处理

1. 样品采集
           根据实验目的设计合理的实验方案，选择要采集的红树林，确定采样位置。红树林样品的采集使用特制的沉积物样品采样器，沉积物样品的采集使用三点或五点取样法。对每个样点的3-5个重复样品进行等量混合以减少采样偏差。根据实验需要可对样品按深度分层，使用无菌自封袋保存。样品需使用冰袋或干冰冷藏运输，实验室内存放于-40/-80 °C冰箱。
2. DNA提取
           参考所使用试剂盒说明书进行。若使用DNeasy PowerSoil Kit，可在机械破碎后增加60 °C水浴30 min，可提高DNA产量。使用NanoDrop确定DNA质量和浓度，并使用1%琼脂糖凝胶电泳检测。质量不好的DNA应重提或使用DNA纯化试剂盒进行纯化。
   
   

二、PCR扩增与PacBio SMRT测序

1. Primers选择
           选择合适的Primer是研究微生物群落的最重要步骤。对于真菌群落的研究通常选用ITS区域。对于ITS全长的扩增，建议优先选用对真菌群落具有极高覆盖度的引物ITS9Munngs/ITS4ngs (Tedersoo and Lindahl, 2016; Nilsson, et al., 2019) 。若上述引物扩增效果较差，可根据情况选用ITS1Fngs/ITS4ngs (White et al., 1990; Tedersoo et al., 2015) 或ITS1F/ITS4 (White et al., 1990; Gardes and Bruns, 1993) 。根据后续测序过程中的混样方案，在正反向引物上下游添加特异barcode信息，barcode长度不小于6 bp，以保证测序后数据的正确拆分。
2. PCR扩增
           PCR扩增中嵌合体的形成与循环数，聚合酶的选择和初始模板质量有很大关系，特别是长片段扩增中更容易出现嵌合体。建议选择高活性高保真度的DNA聚合酶，延长延伸时间 (Tedersoo et al., 2015) 。虽然循环数的增加容易导致嵌合体产生，但扩增效率也会随着片段长度的增加而下降，因而循环数的选择一定要慎重。ITS片段扩增的循环数可以设置为30-32个，不超过35个，当片段长度增加时可以适当增加循环数 (Tedersoo et al., 2015; Nilsson et al., 2019)。PCR扩增前将DNA模板稀释到5-10 ng/μl，以保证扩增过程中模板的一致性。由于三代测序所需DNA量较大，PCR扩增体系可选择30 μl，其中包含1.5 U polymerase，3 μl buffer，150 μM dNTPs，正反向引物各0.12 μM，2-10 ng DNA模板。PCR扩增程序为，94 °C 5 min, 94 °C 30 s, 57 °C 30 s, 72 °C 1 min 20 s, 72 °C 10 min，其中2-4步为32循环。PCR产物使用NanoDrop和1%琼脂糖凝胶电泳检测。每个样品至少设置3个重复，并将其等量混合，在以减少PCR偏差。同时每批次PCR都应设置空白对照。
3. PacBio SMRT测序
           此步骤主要由测序公司完成，简单步骤如下：将加有barcode的PCR产物按照预先设计的混样方案等量混合，然后将发卡测序接头连接到PCR文库并完成环化。使用Enzyme Clean Up Kit对测序文库进行纯化。将测序引物退火结合至PCR产物文库，并将DNA 聚合酶结合测序模板。测序使用PacBio Sequal平台进行。
   
   

三、数据分析

1. CCS (circular consensus sequencing) reads
           PacBio SMRT 通过对环化连接的插入测序片段循环进行多次测序后比对校正纠错，获得高精度的保守序列 (CCS reads) 。当循环测序数达到5次时，CCS reads的质量理论上可以达到QC40，也就是错误率0.01%。PacBio平台产生数据格式为.bam，使用pbccs软件进行环化校正得到CCS reads，命令为ccs cell01.subreads.bam cell01.ccsreads.bam --minPasses 5 --reportFile ccs_report.txt。原始文件为cell01.subreads.bam，输出文件为cell01.ccsreads.bam，--minPasses为循环数，--reportFile为统计结果文件。
2. 数据拆分 (demultiplex)
           准备barcode文件 (Barcodes.fasta) ，根据barcode信息，使用lima软件进行样品拆分：lima --ccs cell01.ccsreads.bam Barcodes.fasta split.bam --same --split-bam --split-bam-named -j 100。其中split.bam文件为输出文件，输出文件将以split.xxx.bam命名，--same表示双端引物相同，--split-bam表示按照barcode pairs拆分bam文件，--split-bam-named表示按照barcode名称对拆分后输出的bam文件命名，-j线程数。另外可先进行步骤3.3 bam转fastq，将cell01.ccsreads.bam文件转换为fastq文件后，根据barcode序列，使用flexbar软件 (Dodt et al., 2012) 进行拆分，命令为flexbar -b Barcodes.fasta -r cell01.ccsreads.fastq -t cell01.ccsreads -bt ANY -be 0.1，-b为barcode序列文件，-r为需要拆分的fastq文件，-t为输出文件前缀，-bt为--barcode-trim-end，ANY表示删除barcode两端序列，-be为--barcode-error-rate。
3. bam转fastq
           使用BAM2fastx软件进行。bam2fastq -o sample1 sample1.ccsreads.bam -u。-o为输出文件前缀，sample1.ccsreads.bam为输入bam文件，-u表示输出文件不压缩。
4. 质控过滤
           使用mothur (Schloss et al., 2009) 进行质控过滤，首先将fastq拆分为序列文件及其对应的质量分数文件fastq.info(fastq=sample1.fastq)，随后进行质控trim.seqs(fasta=sample1.fasta,minlength=100,maxambig=0,maxhomop=12,qfile=sample1.qual,qwindowsize=50,qwindowaverage=20)。
5. 文件及序列重命名
           批量修改文件名以后使用usearch (Edgar, 2010) 对序列按照文件名进行重命名，usearch11 -fastx_relabel sample1.fasta -prefix sample1- -fastaout sample1_relabel.fasta -keep_annots。-prefix为重命名序列前缀，-fastaout为输出文件名。
6. 提取ITS序列
           使用ITSx (Bengtsson-Palme et al., 2013) 进行提取。命令为ITSx -i sample1_relabel.fasta -o sample1_out --cpu 4 --save_regions all --preserve T -E 1e-2。-i输入文件名，-o输出文件名，--cpu核心数，--save_region要保留的片段，all表示保留所有片段，包括18S，28S，ITS全长，ITS1，5.8S和ITS2，--preserve序列名为原始序列名，-E，e-value。此步骤产生的sample1_out.full.fasta文件为ITS全长序列，用于后续分析。
7. 嵌合体检测与删除
           使用vsearch (Rognes et al.,2016) 进行重头嵌合体检测uchime_denovo (Edgar et al., 2011) 和基于数据库的嵌合体检测uchime_ref。uchime_denovo命令：vsearch --uchime_denovo sample1_out.full.fasta --chimeras sample1_out.full_chimeras.fasta --nonchimeras sample1_out.full_nonchimeras.fasta --relabel_keep；uchime_ref命令：vsearch --uchime_ref sample1_out.full_nonchimeras.fasta --chimeras sample1_out.ful_chimeras2.fasta --nonchimeras sample1_out.full_nonchimeras2.fasta --db uchime_reference_dataset_28.06.2017.fasta --relabel_keep --threads 25。重命名文件sample1_out.full_nonchimeras2.fasta为sample1.fasta用于后续分析。
8. 长度筛选
           绝大部分真菌ITS片段的长度为300-900 bp，极少数担子菌可达到1,100 bp (Schoch et al., 2014; Nilsson et al., 2019) 。为避免过长或过短序列干扰，使用vsearch进行片段长度筛选。vsearch --fastx_filter sample1.fasta --fastaout sample1.remian.fasta --fastaout_discarded sample1.discarded.fasta --fastq_maxlen 900 --fastq_minlen 300。
9. OTU生成与代表序列挑选
           主要使用usearch，但由于免费版32位usearch限制，在处理大数据量时结合vsearch共同使用。此步骤可以分为以下步骤：
   
   9.1

   计数与去重
           usearch -fastx_uniques sample1.remian.fasta -fastaout uniques.sample1.fasta -sizeout
   9.2

   去除单条序列
           usearch -sortbysize uniques.sample1.fasta -fastaout desingl.uniques.sample1.fasta -minsize 2。-minsize表示保留序列的最小条数。
   注：以上两步可以在vsearch中合并为一步，vsearch --derep_fulllength sample1.fasta --sizein --fasta_width 0 --sizeout --output desingl.unique.sample1.fasta --minuniquesize 2 --threads 8。
   9.3

   OTU聚类
           usearch10 -cluster_otus desingl.uniques.sample1.fasta -otus sample1.otu.fasta -uparseout sample1.otu.txt -relabel OTU -minsize 2。-otus sample1.otu.fasta输出即为OTU代表序列，usearch10默认选择丰度最高的序列为代表序列。usearch10默认使用UPARSE算法 (Edgar, 2013) 进行OTU聚类，序列相似度阈值为97%，不能更改。若想更改相似度阈值，可选择usearch10以前的早期版本，通过-id 0.97参数进行修改。常用的OTU聚类方法还有CD-HIT等方法 (Fu et al., 2012) ，此处不再赘述。
   9.4

   OTU table生成
           vsearch --usearch_global sample1.fasta --db sample1.otu.fasta --id 0.97 --otutabout sample1.otutable.txt --threads 50。以步骤3.9.3产生的OTU代表序列为数据库 (-db) 对样品数据以97%相似度 (-id) 为阈值进行聚类生成OTU table。
10. 代表序列注释
            使用软件为BLAST+，真菌ITS使用UNITE数据库。有研究表明早期的UNITE数据库中有许多序列都是错误鉴定的，将一些非真菌生物鉴定为真菌，主要为Rozellomycota和一些未知真菌。最新版的UNITE数据库分为真菌和真核两种，真菌数据库主要为真菌序列，真核数据库主要为真核序列，真核数据库相比于真菌数据库更加全面准确，因而建议使用真核数据库。构建数据库：makeblastdb -in UNITE_eukaryotes_all_04.02.2020.fasta -dbtype nucl -out unite_eukaryotes。-dbtype nucl表示数据库类型为核酸序列。注释：blastn -max_target_seqs 10 -db unite_eukaryotes -out otu.rep.seq.euk.blast -query sample1.otu.fasta -num_threads 10 -outfmt "6 qseqid qlen qstart qend salltitles sseqid slen sstart send qcovs bitscore evalue pident"。-max_target_seqs输出比对结果数量，-out输出比对结果文件，-query输入代表序列文件，-num_threads核心数，-outfmt输出文件格式，6表示表格格式，后面内容为比对结果信息。为使注释结果更加可靠，采用Tedersoo等人 (2015, 2018) 使用的注释策略，对于注释在真菌界中的OTU，以90%、85%、80%和75%的序列相似度分别作为属、科、目和纲的区分标准。
11. 系统发育注释 (可选)
            相比于二代测序而言，三代测序获得的更长的微生物maker基因序列可以获得更为精确的注释结果。但是由于人们目前对自然界微生物认识有限，现有数据库中许多微生物并未精确注释，如UNITE真核生物数据库中有许多序列被注释为“Eukaryota_kgd_Incertae_sedis”，同时有许多序列仅通过数十至上百bp的alignment进行了注释，结果不够准确，而且有许多未知微生物的序列并未被包括在数据库中。因而我们提出了基于blastn注释结果的“基于系统发育分析的微生物鉴定”，以更准确的对未知真菌进行注释。简单来说就是使用3.9.3中获得OTU代表序列 (或去除其它真核序列的真菌OTU代表序列) 构建系统发育树。常用构建系统发育树的方法有Neighbor Joining (NJ) ，Maximum Parsimony (MP) ，Maximum Likelihood (ML) 和Bayesian inference (BI) ，几种方法各有优势。此处推荐使用ML方法构建系统发育树，推荐软件有FastTree (号称速度最快的ML树构建软件，一般来简单观察系统发育关系，数据量特别大时使用) (Nguyen et al., 2015)，IQTree (一种精确快速的ML系统发育分析工具，bootstrap计算速度是RAxML的10-40倍，大数据量时强烈推荐) (Price et al., 2010)，和RAxML (最常用的系统发育树构建软件之一，支持多线程和向量指令运行，运行速度较快，数据量不是特别大时推荐使用) (Stamatakis, 2014)，请根据情况酌情选用。序列比对使用MUSCLE (Edgar, 2004) ：muscle -in input.ITS.fas -out aligned.input.ITS.muscle.fas；其中-in为输如fasta序列；-out为输出alignment文件。序列修剪使用trimAl (Capella-Gutierrez et al., 2009) ：trimal -in aligned.input.ITS.muscle.fas -out aligned.input.ITS.muscle.trim.phy -gt 0.1；-in为输如fasta序列；-out为输出alignment文件；-gt序列中允许出现gap的部分。IQTree构建系统发育树：iqtree -s aligned.input.ITS.muscle.trim.phy -m TESTONLY -nt 60 -bb 1000 -alrt 1000；-s为输入alignment文件；-nt为核心数，也可设为AUTO系统自动分配；-bb (ultrafast bootstrap approximation) 重复抽样次数，默认1,000，大数据建议-bb，小数据可用-b；-alrt 是否启用SH-aLRT检验，可删除；-m，model，不提供时iq-tree自动选择；-o可指定外群序列。FastTree构建系统发育树：FastTree aligned.input.ITS.muscle.trim.phy > aligned.input.ITS.muscle.trim.tree；数据量特别大时使用。RAxML构建系统发育树：raxmlHPC-PTHREADS-SSE3 -T 40 -f a -x 12345 -# 1000 -m GTRGAMMA -s ./BAE61387_aligned_sequences.fas.phy -n tre；若CPU支持也可选用raxmlHPC-PTHREADS-AVX或raxmlHPC-PTHREADS-AVX2，可以极大提高运行速度；-T 线程数；-f 选择RAxML算法，a为快速bootstrap分析；-x随机数；-# bootstrap；-m，model，DNA序列常用为GTRGAMMA；-s 输入文件名；-n 输出文件后缀。完成系统发育树构建后，根据OTU所在的系统发育分枝对OTU进行相应的初步注释。
    
    

四、数据统计与分析

        基于步骤三所获得的代表性序列和OTU table对真菌群落的α多样性、β多样性、生物地理学特征、分布与群落结构的影响因素，群落结构的组装过程、共现性关系等内容进行分析与可视化展示，此部分内容繁多，本文中不再赘述。

致谢

        本工作由科技部基础资源调查专项 (2019FY100700) 、国家自然科学基金 (91851105、31970105) 及中国博士后科学基金 (2020M672779) 资助。本文分析方法已应用于待发表文章“High diversity of basal fungal lineages and stochastic processes controlled fungal community assembly in mangrove sediments”。

参考文献

1. Bengtsson-Palme, J., Ryberg, M, Hartmann, M., Branco, S., Wang, Z., Godhe, A., Pierre, D. W., Sanchez-Garc, M., Ebersberger, I., Filipe, D. S., Anthony, S. A., Jumpponen, A., Unterseher, M., Kristiansson, E., Abarenkov, K., Bertrand, Y. J. K., Sanli, K., Eriksson, K. M., Vik, U., Veldre, V. and Nilsson, R. H. (2013). Improved software detection and extraction of ITS1 and ITS2 from ribosomal ITS sequences of fungi and other eukaryotes for analysis of environmental sequencing data. Methods Ecol Evol 4: 914-919.
2. Capella-Gutierrez, S., Silla-Martinez, J. M. and Gabaldon, T. (2009). trimAl: a tool for automated alignment trimming in large-scale phylogenetic analyses. Bioinformatics 25(15): 1972-1973.
3. Dodt, M., Roehr, J., Ahmed, R. and Dieterich, C. (2012). FLEXBAR—Flexible barcode and adapter processing for next-generation sequencing platforms. Biology 1(3): 895-905.
4. Edgar, R. C. (2004). MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res 32(5): 1792-1797.
5. Edgar, R. C. (2010). Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics 26(19): 2460-2461.
6. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C. and Knight, R. (2011). UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics 27(16): 2194-2200.
7. Edgar, R. C. (2013). UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nat Methods 10(10): 996-998.
8. Fu, L., Niu, B., Zhu, Z., Wu, S. and Li, W. (2012). CD-HIT: accelerated for clustering the next-generation sequencing data.Bioinformatics 18(23): 3150-3152.
9. Gardes, M. and Bruns, T. D. (1993). ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes, application to the identification of mycorrihiza and rusts. Mol Ecol 2(2): 113-8.
10. Nguyen, L. T., Schmidt, H. A., von Haeseler, A. and Minh, B. Q. (2015). IQ-TREE: A Fast and Effective Stochastic Algorithm for Estimating Maximum-Likelihood Phylogenies. Mol Biol Evol 32(1): 268-274.
11. Nilsson, R. H., Anslan, S., Bahram, M., Wurzbacher, C., Baldrian, P. and Tedersoo, L. (2019). Mycobiome diversity: high-throughput sequencing and identification of fungi. Nat Rev Microbiol 17(2): 95-109.
12. Price, M. N., Dehal, P. S., and Arkin, A. P. (2010). FastTree 2--approximately maximum-likelihood trees for large alignments.PLoS ONE 5(3): e9490.
13. Rognes, T., Flouri, T., Nichols, B., Quince, C. and Mahe, F. (2016). VSEARCH: a versatile open source tool for metagenomics. PeerJ 4: e2584.
14. Schloss, P. D., Westcott, S. L., Ryabin, T., Hall, J. R., Hartmann, M., Hollister, E. B., Lesniewski, R. A., Oakley, B. B., Parks, D. H., Robinson, C. J., Sahl, J. W., Stres, B., Thallinger, G. G., Van Horn, D. J. and Weber, C. F. (2009). Introducing mothur: Open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Appl Environ Microbiol 75(23): 7537-7541.
15. Schoch, C. L., Robbertse, B., Robert, V., Vu, D., Cardinali, G., Irinyi, L., Meyer, W., Nilsson, R. H., Hughes, K., Miller, A. N., Kirk, P. M., Abarenkov, K., Aime, M. C., Ariyawansa, H. A., Bidartondo, M., Boekhout, T., Buyck, B., Cai, Q., Chen, J., Crespo, A., Crous, P. W., Damm, U., De Beer, Z. W., Dentinger, B. T., Divakar, P. K., Duenas, M., Feau, N., Fliegerova, K., Garcia, M. A., Ge, Z. W., Griffith, G. W., Groenewald, J. Z., Groenewald, M., Grube, M., Gryzenhout, M., Gueidan, C., Guo, L., Hambleton, S., Hamelin, R., Hansen, K., Hofstetter, V., Hong, S. B., Houbraken, J., Hyde, K. D., Inderbitzin, P., Johnston, P. R., Karunarathna, S. C., Koljalg, U., Kovacs, G. M., Kraichak, E., Krizsan, K., Kurtzman, C. P., Larsson, K. H., Leavitt, S., Letcher, P. M., Liimatainen, K., Liu, J. K., Lodge, D. J., Luangsa-ard, J. J., Lumbsch, H. T., Maharachchikumbura, S. S., Manamgoda, D., Martin, M. P., Minnis, A. M., Moncalvo, J. M., Mule, G., Nakasone, K. K., Niskanen, T., Olariaga, I., Papp, T., Petkovits, T., Pino-Bodas, R., Powell, M. J., Raja, H. A., Redecker, D., Sarmiento-Ramirez, J. M., Seifert, K. A., Shrestha, B., Stenroos, S., Stielow, B., Suh, S. O., Tanaka, K., Tedersoo, L., Telleria, M. T., Udayanga, D., Untereiner, W. A., Dieguez Uribeondo, J., Subbarao, K. V., Vagvolgyi, C., Visagie, C., Voigt, K., Walker, D. M., Weir, B. S., Weiss, M., Wijayawardene, N. N., Wingfield, M. J., Xu, J. P., Yang, Z. L., Zhang, N., Zhuang, W. Y. and Federhen, S. (2014). Finding needles in haystacks: linking scientific names, reference specimens and molecular data for Fungi. Database 2014: 1-21.
16. Stamatakis, A., (2014). RAxML version 8: a tool for phylogenetic analysis and post-analysis of large phylogenies. Bioinformatics 30(9): 1312-1313.
17. Tedersoo, L., Anslan, S., Bahram, M., Polme, S., Riit, T., Liiv, I., Koljalg, U., Kisand, V., Nilsson, R. H., Hildebrand, F., Bork, P. and Abarenkov, K. (2015). Shotgun metagenomes and multiple primer pair-barcode combinations of amplicons reveal biases in metabarcoding analyses of fungi.MycoKeys 10: 1-43.
18. Tedersoo, L. and Lindahl, B. (2016). Fungal identification biases in microbiome projects.Env Microbiol Rep 8(5): 774-779.
19. Tedersoo, L., Tooming-Klunderud, A. and Anslan, S. (2018). PacBio metabarcoding of Fungi and other eukaryotes: errors, biases and perspectives. New Phytol 217(3): 1370-1385.
20. White, T. J., Bruns, T. D., Lee, S. B. and Taylor, J. W. (1990). Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJWT, editors. PCR protocols: a guide to methods and applications. New York: Academic Press, p. 315-22.