摘要:耐热性是乳酸菌运用于生产的一个十分重要的指标,确认益生菌的热稳定性和优化阈值热在工业应用中有重要意义。益生菌若在高温下具有较高的生存率则更具有工业优势,有利于应用于生产。耐热实验将一株细菌菌液分别置于一个温度梯度下,处理一定时间后,根据生存率评估细菌的耐热性。
关键词: 耐热, 乳酸菌, 温度梯度, 稀释涂布法, 生存率
材料与试剂
- 涂布器
- 离心管 (1.5 ml,15 ml)
- MRS肉汤培养基 (赛默飞,CM1175)
- 琼脂 (生工,A505255)
- PBS缓冲液 (国药,HYSH3025601)
- MRS固体培养基 (见溶液配方)
- MRS液体培养基 (见溶液配方)
仪器设备
- 量筒
- 玻璃棒
- 涂布器
- 移液枪
- 恒温水浴锅 (江苏荣华仪器,HH-4)
- 90 mm塑料培养皿 (biosharp BS-90-D)
- 纯水制备仪 (ELGA PURELAB系列)
- 吸头 (生工,F601227)
- 烘箱 (天津泰斯特101-0AB型电热鼓风干燥箱)
- 厌氧培养箱 (Whitley, DG250)
- 超净工作台 (天津泰斯特,CJ-2D)
- 10 μl, 20 μl接种环 (生工,F619312)
- 高压灭菌锅 (上海庆开,GI54TW)
- 冰箱 (美菱)
- 摇床 (Eppendorf ThermoMixer C恒温混匀仪)
实验步骤
一、制备细菌悬液 (以下操作均于超净工作台上进行)
- 将待测菌株从-80 °C冰箱取出置于冰盒上,用无菌接种环采用连续划线的方式将待测菌株接种于MRS固体培养基,37 °C厌氧培养箱中倒置培养24 h。
- 从厌氧培养箱中取出培养皿,用灭菌后的牙签或枪头挑取平板上由单个菌生长成的单菌落,接种于装有1 ml MRS液体培养基的微型离心管(1.5 ml或2.0 ml)中,搅拌或吹打混匀 (谢凤珍等,2014)。做好标记置于37 °C厌氧培养箱中静置培养12 h,直至OD600约为3.0。
- >将步骤2培养后的菌液震荡混匀,取100 μl转移至装有900 μl MRS液体培养基的微型离心管中,做好标记置于37 °C厌氧培养箱继续静置培养18 h。直至OD600约为3.0。
- 重复步骤3以充分活化乳酸菌。
- 将步骤4培养后的菌液震荡混匀,取1 ml菌液转移至装有30 ml MRS液体配养基的灭菌小锥形瓶中,轻轻混匀置于37 °C厌氧培养箱静置培养24 h,直至OD600约为3.0。
- 取10 ml锥形瓶中菌液至15 ml离心管中,盖上盖子颠倒混匀,再从中取1.5 ml菌液于2.0 ml微型离心管中,共取四管。分别编号为1,2,3,4。
注:不能直接取用锥形瓶中的菌液,避免上下层菌液不均匀影响实验结果。
二、将菌液进行热处理
将编号为1,2,3,4的菌液分别至于预调到37 °C, 50 °C, 60 °C, 70 °C的水浴锅中处理5 min,处理后立即放在冰盒中。
注:处理温度和时长可根据细菌的耐受情况进行适当调整。
三、测定存活细菌数
- 用灭菌PBS缓冲液对热处理后的菌液进行梯度稀释至10-3,10-4,10-5(周平等,2014)。
- 分别取上述稀释倍数的菌液10 μl,用无菌接种环或涂布器将菌液均匀涂布于MRS固体培养基上,待干燥后将培养皿于37 °C厌氧培养箱中倒置培养24 h。每个稀释倍数3个重复。
- 次日观察培养皿上的菌落生长情况,数出培养皿上的菌落数(菌落数在30-300为有效),每个稀释倍数的三个重复组的菌落数取平均值为实验结果,与对照组(37 ℃热处理组)菌落数的比值即为该菌在该温度下的生存率。
四、计算生存率
Survival (%) =CFU/ml (t) ×100/CFU/ml (t0)
结果与分析
- 耐热实验结果
本实验待测菌为HSM-1,HSM-10,HSM-14,HSM-18四株乳酸菌。热处理后HSM-1表现出最高的存活率,其次是HSM-10和HSM-14。50 °C热处理5 min后,HSM-1 存活率为74.6% ,HSM-10和HSM-14的生存率分别为57.5%和32.7%,而HSM-18的热处理后存活率最低为9.0% 。60 °C热处理5 min后,HSM-1存活率为74.2%。HSM-10和HSM-14的生存率分别下降到14.4%和11.6% (Chen et al., 2020)。在70 °C热处理后,菌株存活率下降不到1%。这些结果表明,在50 °C和60 °C条件下,与其他三种菌株相比,HSM-1具有更好的耐热性,更利于工业化应用。
表1. 四种乳酸菌体外耐热实验结果 (Chen et al., 2020)
失败经验
一、失败原因
- 操作过程中没有进行严格的无菌操作。
- 细菌活化程度低,导致后期生长速度太慢。
- 细菌接种后菌落数太多或太少,使实验结果不精确。
二、补救经验
- 若平板染菌则重新用储存在4 ℃冰箱的的菌液重新稀释涂布于MRS固体培养基进行实验。
- 把握活化细菌时的培养时间,取对数期生长的细菌进行实验。
- 进行多个稀释倍数处理,以找到数量适宜的培养皿进行数数。
溶液配方
- MRS固体培养基配方 (1,000 ml)
- MRS液体培养基配方 (1,000 ml)
MRS培养基灭菌温度为115 °C、20 min。
致谢
感谢国家自然科学基金青年项目 (31700004) ,全国大学生平台创新和创业培训项目(S202010542046),湖南省大学生研究性学习与创新实验项目(S201910542041),湖南省科技厅创新人才与平台计划 (2019RS5001) ,湖南创新型省份建设专项经费 (2019RS3022) 的支持。
参考文献
- 谢凤珍,华承伟,牛宏阳.(2014).耐热木聚糖酶源细菌筛选、鉴定及酶学性质[J].河南科技学院学报(自然科学版),42(05):7-10.
- 周平,罗惠波,黄丹,邓波,王庆,黄治国,卫春会,邓杰.(2016).中高温大曲中一株耐热细菌的分离鉴定及其风味代谢产物分析[J].食品工业科技,37(24):215-220.
- Chen,T.,Wang,L.,Li,Q.,Long,Y.,Lin,Y.,Yin,J.,Zeng,Y.,Huang,L.,Yao,T.,Abbasi,M.N.,Yang,H.,Wang,Q.,Tang,C.,Khan,T.A.,Liu,Q.,Yin,J.,Tu,Q.,&Yin,Y.(2020).Functionalprobiotics of lactic acid bacteria from Hu sheep milk. BMC microbiology 20(1), 228.
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:陈雨薇, 李琴心, 齐益宁, 尹佳. (2021). 乳酸菌的耐热实验. // 微生物组实验手册.
Bio-101: e2003726. DOI:
10.21769/BioProtoc.2003726.
How to cite: Chen, Y. W., Li, Q. X., Qi, Y. N. and Jin, J. (2021). Heat Resistance Test of Lactic Acid Bacteria. // Microbiome Protocols eBook.
Bio-101: e2003726. DOI:
10.21769/BioProtoc.2003726.