摘要:益生菌定植肠道的前提是能够通过一系列物理和化学障碍到达肠道,故潜在益生菌应对酸和胆汁应具备良好的耐受性。本文介绍了怎样评估乳酸菌对酸和胆碱的耐受能力以及在体外模拟胃肠道的情况下,通过比较低pH环境和高胆汁浓度环境,评价乳酸菌菌株作为益生菌的可行性。
关键词: 乳酸菌, 耐酸耐胆碱性, 模拟胃肠道, 体外
材料与试剂
- 90 mm塑料培养皿 (biosharp, catalog number: BS-90-D)
- 吸头 (生工,catalog number: F601227)
- 0.45 μm滤膜
- 离心管
- 胰蛋白胨 (生工,catalog number: A505250)
- 酵母粉 (生工,catalog number: A515245 酵母提取物)
- 氯化钠 (上海沪试)
- 琼脂 (生工,catalog number: A505255)
- LB肉汤培养基 (生工,catalog number: A507002)
- MRS肉汤培养基 (赛默飞,catalog number: CM1175)
- 胰蛋白酶 (国药,catalog number: 64008860)
- 胃蛋白酶 (生工,catalog number: A600688-0100)
- 牛胆碱 (西格玛,catalog number: B8631)
- 生理盐水 (医用)
仪器设备
- pH计
- 量筒
- 玻璃棒
- 离心机 (艾本德5424)
- 紫外分光光度计 (北京普析)
- 纯水制备仪 (ELGA PURELAB系列)
- 移液器 (Eppendorf Research plus 单道固定量程移液器)
- 烘箱 (天津泰斯特101-0AB型电热鼓风干燥箱)
- 厌氧培养箱 (Whitley,DG250)
- 超净工作台 (天津泰斯特,CJ-2D)
- 10 μl接种环 (生工,F619312)
- 高压灭菌锅 (上海庆开,GI54TW)
- 冰箱 (美菱)
- 摇床 (Eppendorf ThermoMixer C恒温混匀仪)
软件
- Excel
实验步骤
一、益生菌的引种
- 实验用乳酸菌可以由自然界或者经加工的产品中分离而来,需保证菌种的纯洁性,无微生物污染。确定菌种之后,可以提取基因组DNA,结合 PCR 及 DNA 测序,BLAST分析进一步确认菌种的纯度,检测其生长情况,是否传代正常。
二、测试益生菌对酸和胆碱的耐受能力
- 试剂的配制
- 菌种的准备
注:全过程都要在超净工作台上进行,需要严格无菌操作。 - 检测对酸和胆盐的耐受程度
- 体外模拟胃肠道检测对酸和胆碱盐的耐受性注:平板上所长菌落需在30-300之间才为有效。
结果与分析
- 检测对酸和胆盐的耐受程度
图1. 4株乳酸菌在酸性pH条件下培养12 h后的存活状况 (Chen et al., 2020)
图2. 4株乳酸菌在不同胆碱盐条件下培养12 h的存活情况 (Chen et al., 2020)
- 体外模拟胃肠道检测对酸和胆碱盐的耐受性
图3. 4株乳酸菌在体外模拟胃肠道条件下的存活情况 (Chen et al., 2020)
溶液配方
- MRS固体培养基 1,000 ml
MRS培养基粉末 52 g
琼脂粉 14.4 g
- MRS液体培养基 1,000 ml
MRS培养基粉末 52 g
注:MRS培养基灭菌温度为115 °C、20 min,锥形瓶等灭菌温度为120 °C、20 min。
- 模拟胃液 100 ml
生理盐水 100 ml
0.1 mol/L HCl 1.01 ml
胃蛋白酶 0.3 g
注:用调节生理盐水 (质量分数为0.9%) 的pH至3.0,灭菌后加入胃蛋白酶,由于生理盐水的实际pH值与理论pH可能不一致,实际用于调节pH所用的0.1 mol/L HCl的量与理论可能存在偏差。
- 模拟胰液100 ml:
生理盐水 100 ml
0.1 mol/L NaOH 1.01 ml
牛胆碱 0.9 g
胰蛋白酶 0.1 g
注:调节生理盐水 (质量分数为0.9%) 的pH至8.0,灭菌后加入胰蛋白酶,随后加入牛胆碱并使其充分溶解。由于生理盐水的实际pH值与理论pH可能不一致,实际用于调节pH所用的0.1 mol/L NaOH的量与理论可能存在偏差。
致谢
感谢国家自然科学基金青年项目 (31700004),全国大学生平台创新和创业培训项目(S202010542046),湖南省科技厅创新人才与平台计划 (2019RS5001),湖南创新型省份建设专项经费 (2019RS3022) 的支持。
参考文献
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- Corcoran, B. M., Stanton, C., Fitzgerald, G. F. and Ross, R. P. (2005). Survival of probiotic lactobacilli in acidic environments is enhanced in the presence of metabolizable sugars. Appl Environ Microbiol 71(6): 3060-3067.
- Chen, T., Wang, L., Li, Q., Long, Y., Lin, Y., Yin, J., Zeng, Y., Huang, L., Yao, T., Abbasi, M. N., Yang, H., Wang, Q., Tang, C., Khan, T. A., Liu, Q., Yin, J., Tu, Q. and Yin, Y. L. (2020). Functional probiotics of lactic acid bacteria from Hu sheep milk. BMC Microbiol 20(1): 228.
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:李琴心, 齐益宁, 陈雨薇, 尹佳. (2021). 乳酸菌对酸和胆碱盐的耐受能力. // 微生物组实验手册.
Bio-101: e2003728. DOI:
10.21769/BioProtoc.2003728.
How to cite: Li, Q. X., Qi, Y. N. Chen, Y. W. and Yin, J. (2021). The Tolerance of Lactic Acid Bacteria to Acid and Choline Salts. // Microbiome Protocols eBook.
Bio-101: e2003728. DOI:
10.21769/BioProtoc.2003728.