摘要:猪作为重要的肉用畜种和模式动物,对维持人类的生长与健康至关重要。研究猪肠道微生物的组成与功能对维持猪的生长与健康十分关键,研究结果同时可为人类的营养与健康研究提供参考。本文结合实验室的研究概括整理了猪肠道微生物体外培养与功能研究的一些常用方法。着重介绍了肠道微生物样品的采集与处理、微生物批次培养与连续培养的常用方法。同时结合不同的实验目的讨论了培养过程中采样的设计以及用于后续代谢物分析的样品处理方法。本文所述方法参考了部分人上的研究结果,结合猪相关实验的特点进行了阐述。所介绍的方法可用于研究猪肠道微生物对特定日粮成分的代谢以及相关的微生物及微生物代谢物。同时可为肠道微生物来源的功能化合物的机制研究与功能开发提供基础。
关键词: 肠道微生物, 猪, 体外培养, 微生物区系, 代谢
材料与试剂
- 灭菌棉拭子
- 一次性无菌橡胶手套
- 灭菌纱布
- 枪头:10 μl、200 μl、1000 μl
- 移液管:5 ml、10 ml
- 离心管:1.5 ml、2 ml、15 ml、50 ml
- 无菌注射器:1 ml、5 ml
- 0.22 μm针式滤器(上海生工,目录号:F513163)
- Hungate厌氧管
- 150 ml血清瓶
- 蓝盖试剂瓶:250 ml
- 玻璃珠:3-4 mm
- 锆珠:0.1 mm直径(Biospec,目录号:11079101z)
- CO2气体
- 试验动物:商品猪或土种猪(根据实验目的确定性别、日龄、日粮)
- 微生物总DNA提取试剂盒:QIAamp Fast DNA Stool Mini(QIAGEN,目录号:51604)
- 微生物RNA保护试剂:RNAprotect Bacteria Reagent (QIAGEN,目录号:76506)
- 微生物总RNA提取试剂盒:RNeasy Mini Kit(QIAGEN,目录号:74104)
- 第一链反转录试剂盒:SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix kit(Thermo Fisher,目录号:18080400)
- 厌氧磷酸盐缓冲溶液(PBS;pH 7.4,见溶液配方)
- 0.1%吐温80生理盐水溶液
- 刃天青溶液(见溶液配方)
- 微量元素溶液(见溶液配方)
- 碳酸氢钠溶液(见溶液配方)
- 脂肪酸溶液(见溶液配方)
- 微量元素溶液(见溶液配方)
- 血红素溶液(见溶液配方)
- 还原剂溶液(见溶液配方)
- 维生素母液(见溶液配方)
- 氨基酸母液(见溶液配方)
- 40%厌氧甘油(见溶液配方)
- 灭菌厌氧生理盐水(见溶液配方)
仪器设备
- 移液器(Eppendorf,型号:2.5 μl、10 μl、100 μl、200 μl、1000 μl)
- 电动助吸器(Eppendorf,型号:5-50 ml)
- 高压蒸汽灭菌锅(Sanyo,型号:MLS-3750)
- 离心机(Eppendorf,型号:5810 R)
- 超纯水系统(Sartoris,型号:Arium Pro VF)
- PCR 仪(Bio-rad,型号:DNAengine)
- 涡旋混匀仪(Scientific Industries,型号:SI Vortex Genie 2)
- 冷藏冷冻冰箱(西门子,型号:BCD-610W)
- 超低温冰箱(Thermo,型号:MLT)
- 恒温培养箱(上海恒字,型号:PYX-DHS.500BS)
实验步骤
- 培养基的制备
- 猪肠道接种物的制备
- 微生物的体外培养
- 培养物样品的核酸提取
- 代谢物的提取
溶液配方
- 0.1%吐温80生理盐水溶液
将1 g吐温80、0.21 g NaS·9H2O溶解于1 L生理盐水中,通入CO2气体1 h,121 °C高压灭菌20 min,冷却至室温备用。 - 厌氧磷酸盐缓冲溶液(PBS;pH 7.4)
称取0.2 g KCl、8 g NaCl、0.2 g KH2PO4、1.44 g Na2HPO4、0.21 g NaS·9H2O,加入至900 ml超纯水溶解,将pH调节7.4左右并定容至1 L,通入CO2气体1 h,121 °C高压灭菌20 min,冷却至室温备用。 - 刃天青溶液
称取50 mg刃天青完全溶解于50 ml超纯水中,4 °C保存。 - 微量元素溶液 (Dai et al., 2010)
准确称量25 mg MnCl2·4H2O、25 mg ZnCl2、20 mg FeSO4·7H2O、25 mg CuCl2·2H2O、50 mg SeO2、50mg CoCl2·6H2O、250 mg NiCl2·6H2O、250 mg Na2MoO4·2H2O、31.4 mg NaVO3和250 mg H3BO3,溶解于20 ml 20 mM盐酸溶液中,使用煮沸的去离子水定容至1 L,4 °C保存。 - 碳酸氢钠溶液 (Dai et al., 2010)
称取8.2 g Na2CO3于100 ml煮沸的去离子水中,并持续通入CO2气体20 min。 - 脂肪酸溶液 (Dai et al., 2010)
准确量取6.85 ml乙酸、3.00 ml丙酸、1.84 ml丁酸及0.55 ml戊酸溶解于0.2 M NaOH溶液中,并定容至1 L,4 °C保存。 - 血红素溶液
称取0.1 g氯化血红素溶解于少量0.05 M NaOH溶液,用灭菌水定容至1 L,4 °C保存。 - 还原剂溶液 (Williams et al., 2005)
称取20.5 g NaS·9H2O溶于1 L去离子水中,通入CO2气体1 h,使用前需用0.22 μm滤器过滤除菌,4 °C保存。 - 维生素母液 (Williams et al., 2005)
称取泛酸钙160 mg、生物素250 mg、烟酸160 mg、对氨基苯甲酸20 mg、盐酸吡哆胺500 mg、盐酸吡哆醇20 mg、核黄素160 mg以及盐酸硫胺素160 mg,定容于1 L去离子水中混合均匀,经0.22 μm滤器过滤除菌后4 °C保存。 - 氨基酸母液
称取92.5 mg天冬酰胺和219.3 mg谷氨酰胺,加入10 ml去离子水溶解,经0.22 μm滤器过滤除菌,现配现用。 - 40%厌氧甘油
量取80 ml丙三醇、称取40 mg NaS·9H2O溶解于120 ml煮沸的去离子水中,通入CO2气体1 h以上,121 °C高压灭菌20 min,4 °C保存。 - 灭菌厌氧生理盐水
称取9 g NaCl、40 mg NaS·9H2O溶于1 L去离子水中,通入CO2气体1 h,121 °C高压灭菌20 min,冷却至室温备用。 - 完全合成培养基中氨基酸和胺盐的含量 (Dai et al., 2010; 2012)
表1 完全合成培养基中氨基酸和胺盐的含量
成分 | 含量(mmol/L) | 成分 | 含量(mmol/L) |
天冬氨酸(Asp) | 1.5 | 蛋氨酸(Met) | 0.4 |
谷氨酸(Glu) | 2.6 | 缬氨酸(Val) | 1.0 |
丝氨酸(Ser) | 1.4 | 苯丙氨酸(Phe) | 0.8 |
组氨酸(His) | 0.5 | 异亮氨酸(Ile) | 0.9 |
甘氨酸(Gly) | 1.8 | 亮氨酸(Leu) | 1.7 |
苏氨酸(Thr) | 0.8 | 鸟氨酸(Orn) | 0.5 |
瓜氨酸(Cit) | 0.1 | 赖氨酸(Lys) | 1.0 |
精氨酸(Arg) | 1.0 | 脯氨酸(Pro) | 1.7 |
牛磺酸(Tau) | 0.1 | 半胱氨酸(Cys) | 0.3 |
丙氨酸(Ala) | 1.8 | 天冬酰胺(Asn) | 0.7 |
酪氨酸(Tyr) | 0.9 | 谷氨酰胺(Gln) | 1.5 |
色氨酸(Trp) | 0.2 | 氯化铵(NH4Cl) | 0.4 |
致谢
本实验室的研究工作得到了国家“十三五”重点研发计划(2017YFD0500501)、国家自然科学基金面上项目(32072689)、国家重点基础研究计划(2013CB127303)、国家自然科学基金青年基金(31301979)以及动物消化道营养国际联合研究中心开放课题的资助。
参考文献
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- Williams, B. A., Bosch, M. W., Boer, H., Verstegen, M. W. A., Tamminga, S. (2005). An in vitro batch culture method to assess potential fermentability of feed ingredients for monogastric diets. Anim Feed Sci Technol., 123(part-P1), 445-462.
- Dai, Z. L., Zhang, J., Wu, G. and Zhu, W. Y. (2010). Utilization of amino acids by bacteria from the pig small intestine. Amino acids, 39(5), 1201–1215.
- Dai, Z. L., Li, X. L., Xi, P. B., Zhang, J., Wu, G. and Zhu, W. Y. (2012). Metabolism of select amino acids in bacteria from the pig small intestine. Amino acids, 42(5), 1597–1608.
- Gong, J., Forster, R. J., Yu, H., Chambers, J. R., Sabour, P. M., Wheatcroft, R. and Chen, S. (2002). Diversity and phylogenetic analysis of bacteria in the mucosa of chicken ceca and comparison with bacteria in the cecal lumen. FEMS Microbiol Lett, 208(1), 1–7.
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- Ziemer C. J. (2014). Newly cultured bacteria with broad diversity isolated from eight-week continuous culture enrichments of cow feces on complex polysaccharides. Appl Environ Microbiol., 80(2), 574–585.
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:伍师哲, 刘沫言, 宋庆庆, 张连华, 成艳芬, 朱伟云, 戴兆来. (2021). 猪肠道微生物的体外培养与功能研究. // 微生物组实验手册.
Bio-101: e2003732. DOI:
10.21769/BioProtoc.2003732.
How to cite: Wu, S. Z., Liu, M. Y., Song, Q. Q., Zhang, L. H., Cheng, Y. F. Zhu, W. Y. and Dai, Z. L. (2021).
In vitro Incubation and Functional Study of the Pig Intestinal Microbiota. // Microbiome Protocols eBook.
Bio-101: e2003732. DOI:
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