基于DNA宏条形码的水体浮游细菌群落测序建库方法
Library Construction for DNA Metabarcoding of Bacterioplankton Communities in Waters   

材料与试剂

1. 移液器吸头、离心管
   
2. 96孔板和封板膜 (Roche, LightCycler 480 Multiwell Plate 96)
   
3. DNA提取试剂盒 (MP Biomedicals, FastDNA Spin Kit)
   
4. 高保真PCR酶试剂 (New England Biolabs, Phusion High-Fidelity PCR Master Mix)
   
5. 电泳上样缓冲液Loading buffer (Takara, 6× Loading Buffer, Cat. No. 9156)
   
6. 琼脂糖粉末 (Sigma, A9539-250G)
   
7. TAE溶液 (Solarbio, 50× TAE)
   
8. DNA Marker (New England Biolabs, 50 bp DNA Ladder, NEB #B7025)
   
9. 凝胶纯化试剂盒 (南京诺唯赞, DC301-01)
   
10. Qubit分子定量试剂盒 (Promega, QuantiFlour dsDNA System)
    

仪器设备

1. 移液器 (Eppendorf, 100–1000 μl, 10–100 μl 20–200 μl, 2–20 μl, 0.5–10 μl, 0.1–2.5 μl)
   
2. 均质仪 (杭州奥盛, Bioprep-24)
   
3. 离心机 (Eppendorf, 5417R)
   
4. 干式加热器 (Labnet, D1100-230V)
   
5. 超净工作台 (苏净安泰, Airtech)
   
6. 漩涡混合器 (海门其林贝尔, Vortex-6)
   
7. 200 μl八联移液器 (Brand, 10-200 μl)
   
8. 96孔板离心机 (杭州奥盛, Mini-P25)
   
9. PCR热循环仪 (Bio-Rad, S1000)
   
10. 电泳仪 (北京六一, DYY6C)
    
11. 电泳槽 (北京六一, JYCP31DN)
    
12. 凝胶成像仪 (上海培清, JS-680B)
    
13. 核酸测定仪 (ThermoFisher, Qubit 4.0)
    

实验步骤

1. 水体环境样品DNA提取
   
   1.1

   将超净工作台用75%酒精擦拭干净，再使用紫外灯灭菌20 min，将小剪刀和镊子放在酒精灯上反复灼烧灭菌后冷却至室温，用镊子夹住滤膜 (提前过滤富集好浮游细菌)，使用剪刀将载有浮游细菌的滤膜剪成小碎片后，全部装入DNA提取试剂盒的细胞破碎管中。严格参考DNA提取试剂盒中的步骤进行滤膜全基因组DNA提取 (期间会使用均质仪)。材料与试剂中的DNA提取试剂盒供参考，也可使用其他品牌的试剂盒。
   1.2

   使用60 μl的无菌TE溶液对提取的DNA进行洗脱，再用超微量紫外分光光度计测定含量和纯度，然后将提取的DNA置于-80 °C冰箱保存。注意：装DNA的离心管必须仔细标记样品编号ID、滤膜粒径、过滤水样体积和采集时间，每条信息至少标记两遍。所有离心管和枪头使用前必须灭菌并烘干。
2. 浮游细菌的PCR扩增
   
   2.1

   将提取好的环境样品DNA进行分组建库，30个样品建一个库，样品编号ID和顺序提前记录在实验记录本上。
   2.2

   根据自己的实验需要，选择合适的16S rRNA基因通用引物，本文中以常用的16S rDNA V3–V4可变区引物341F和806R为例进行介绍。预先合成带有barcode信息的引物序列。其中6 bp长的barcode序列分别分布在两条引物的5'端。本研究中一共需要6条携带不同barcode的正向引物和6条携带不同barcode的反向引物，具体的barcode序列见表1。
   
   表1. 浮游细菌群落建库测序中所用的引物序列信息，以16S rRNA基因V3–V4可变区为例

   引物名称	Barcode序列	引物序列
   341F_B1	ACAGTG	CCTAYGGGRBGCASCAG
   341F_B2	ATCACG	CCTAYGGGRBGCASCAG
   341F_B3	CGATGT	CCTAYGGGRBGCASCAG
   341F_B4	GCCAAT	CCTAYGGGRBGCASCAG
   341F_B5	TGACCA	CCTAYGGGRBGCASCAG
   341F_B6	TTAGGC	CCTAYGGGRBGCASCAG
   806R_B1	CAGATC	GGACTACNVGGGTWTCTAAT
   806R_B2	GATCAG	GGACTACNVGGGTWTCTAAT
   806R_B3	AGTTCC	GGACTACNVGGGTWTCTAAT
   806R_B4	GTAGAG	GGACTACNVGGGTWTCTAAT
   806R_B5	ATGAGC	GGACTACNVGGGTWTCTAAT
   806R_B6	CACGAT	GGACTACNVGGGTWTCTAAT

   
   
   2.3

   将合成好的引物放入离心机中，14,000 × g离心3 min，在超净工作台中将引物用无菌去离子水稀释到10 μM的浓度 (超净工作台应提前按步骤1中的方法灭菌)，使用1.5 ml无菌离心管，将正反引物分别取30 μl混合在一起，并将混合好的引物对编号。具体编号原则见表2，由于本研究中一个库仅包括30个样品，这里仅混合前30对引物，后6对引物备用。
   
   表2. 不同组合引物对的编号
   

   引物对编号	引物组合	引物对编号	引物组合
   16S1	341F_B1+806R_B1	16S19	341F_B4+806R_B1
   16S2	341F_B1+806R_B2	16S20	341F_B4+806R_B2
   16S3	341F_B1+806R_B3	16S21	341F_B4+806R_B3
   16S4	341F_B1+806R_B4	16S22	341F_B4+806R_B4
   16S5	341F_B1+806R_B5	16S23	341F_B4+806R_B5
   16S6	341F_B1+806R_B6	16S24	341F_B4+806R_B6
   16S7	341F_B2+806R_B1	16S25	341F_B5+806R_B1
   16S8	341F_B2+806R_B2	16S26	341F_B5+806R_B2
   16S9	341F_B2+806R_B3	16S27	341F_B5+806R_B3
   16S10	341F_B2+806R_B4	16S28	341F_B5+806R_B4
   16S11	341F_B2+806R_B5	16S29	341F_B5+806R_B5
   16S12	341F_B2+806R_B6	16S30	341F_B5+806R_B6
   16S13	341F_B3+806R_B1	16S31	341F_B6+806R_B1
   16S14	341F_B3+806R_B2	16S32	341F_B6+806R_B2
   16S15	341F_B3+806R_B3	16S33	341F_B6+806R_B3
   16S16	341F_B3+806R_B4	16S34	341F_B6+806R_B4
   16S17	341F_B3+806R_B5	16S35	341F_B6+806R_B5
   16S18	341F_B3+806R_B6	16S36	341F_B6+806R_B6

   
   
   2.4

   在超净工作台中配制PCR反应试剂，按PCR高保真酶的说明书，加入适量的酶、缓冲液、dNTP、无菌去离子水，反应试剂总量按100个反应量配制，注意先不加引物和DNA模板，使用漩涡震荡仪进行混匀后，14,000 × g离心2 min。
   2.5

   在超净工作台中取出无菌的96孔PCR板，放入合适的96孔板冰盒中，在96孔板的第1列、第4列、第7列和第10列的每个孔中分别加入54 μl上述步骤配制好的PCR反应试剂。
   2.6

   在超净工作台中分别将步骤2.3中混合好的30对引物依次加入到96孔板中，每个引物对加入3 μl，具体加入的位置见图1。其中NG代表阴性对照，任选6对引物对，6个孔中每个孔加入1 μl，并在实验记录本上做好记录，下一次PCR时更换没测试过的6对引物进行阴性对照。
   
   
   图1. 30对引物加入的位置图 (其中数字序号1–30是30份样品，使用第1到第30组混合引物对)
   
   
   2.7

   在超净工作台中将2.1中提前分组的30个样品DNA模板依次加入96孔板序号1-30的孔中（图1），每个孔中加入3 μl，注意NG孔中不要加入任何DNA模板。
   2.8

   在超净工作台中使用200 μl八联移液器，量程设置为50 μl，选择“mix”模式，分别对96孔板中第1列、第4列、第7列和第10列 (前6个孔) 进行吹打混匀，混合次数不少于10次，混合时将移液器吸头放到液面以下，尽量避免生成气泡。用八联移液器分别从第1列、第4列、第7列和第10列 (前6个孔) 中吸取20 μl反应液到第2-3列、第5-6列、第8-9列和第11-12列，贴上96孔板封板膜，用硬纸片将封板膜与96孔板压紧，贴牢，再使用96孔板离心机离心5 min。注意：从第10列分装体系到11-12列时，最下面2排阴性对照孔不要分装，必须单独处理。
   2.9

   将离心后的96孔板放入PCR仪中，设置反应条件进行PCR扩增。PCR条件主要依据所使用的Taq酶、产物长度、引物退火温度以及DNA模板浓度来决定。本示例中的PCR反应条件为：95 °C 5 min后，进行25–30个循环 (循环数依据DNA模板的浓度来决定，不宜超过30次，防止非特异性扩增)。包括95 °C变性30 s、55 °C退火30 s和72 °C延伸30 s，最后再72 °C延伸5 min后降温到4 °C，PCR反应完成。注意：退火温度和延伸时长根据所选引物进行调整优化。
3. PCR结果的电泳检测
   
   3.1

   将PCR反应后的96孔板使用96孔板离心机离心5 min，去掉封板膜。
   3.2

   使用200 μl八联移液器，分别将第2-3列、第5-6列、第8-9列和第11-12 (前6排孔) 的样品分别转移回第1列、第4列、第7列和第10列 (前6排孔) 中。
   3.3

   分别往96孔板第1列、第4列、第7列和第10列 (前6排孔) 中加入10 μl的loading buffer染料，最后6个阴性对照孔中分别加入4 μl的loading buffer，分别混合均匀。
   3.4

   使用1× TAE溶液和琼脂糖粉末，配置2%质量体积比的琼脂糖凝胶，配置时，初始TAE溶液可以适量加多一点，防止微波加热蒸发损失。例如，2.8 g琼脂糖粉末加入到150 ml 1× TAE溶液中，混合均匀后，微波炉中火加热10 min，待琼脂糖完全溶化后加入10 μl电泳染料，选择合适的制胶梳子制作成琼脂糖凝胶，确保凝胶中每个孔至少可以容纳50 μl PCR产物。
   3.5

   待琼脂糖凝胶完成凝固后，将其放置于装有1× TAE溶液的电泳槽中，凝胶需要完全浸泡在TAE溶液中。分别将50 μl加好loading buffer的PCR产物加入凝胶孔中，每加好一个样品要间隔一个孔，凝胶上每一排最后一个孔需要加入10 μl的DNA Marker。最后将6个阴性对照样品全部加入凝胶孔中，每个对照之间要间隔一个孔。选择80 V、100 mA的电泳条件，电泳30 min。
   3.6

   将电泳完毕的凝胶放置于凝胶成像仪中，调整光圈和焦距以及凝胶的位置，首先检查6个阴性对照中是否存在目标条带，如果任一阴性样品有条带则丢弃凝胶，必须分析细菌污染原因、回顾实验过程，优化改进后重新进行PCR。如果6个阴性样品全都没有条带，再基于DNA Marker检查30个样品的PCR产物是否有目标条带，如果30个样品都有单一、清晰的目标条带，则继续后续实验；若有部分样品无条带或有杂带则该样品需要重新PCR。
4. PCR目标条带回收纯化
   
   4.1

   用75%酒精棉球擦拭切胶刀片后，在凝胶成像仪中将30个样品的目标条带小心地切下来，每切完一个样品要重新用酒精棉球擦拭，放置于2 ml无菌离心管中。
   4.2

   严格按照“凝胶纯化试剂盒”参考手册中的步骤进行凝胶纯化，最终纯化DNA的洗脱体积为20 μl，在最终的离心管上写明样品编号信息，做好双重标记，放置于-80 °C冰箱保存或直接进行后续浓度测定。
5. 纯化DNA浓度测定及混库
   
   5.1

   按照Qubit分子定量试剂盒参考手册中的步骤进行染料配制，一个样品需要配制染料溶液200 μl，一般按样品总需求量的110%比例配制。将200 μl配制好的染料加入到650 μl容量的小离心管中，离心管盖和管壁上都标上相应的样品编号，在相应的离心管中加入2 μl纯化好的PCR产物DNA，漩涡震荡混匀后，10,000 × g离心2 min。
   5.2

   将Qubit分子定量试剂盒中100 ng/μl的DNA标准品用无菌去离子水分别稀释到50、25、10和5 ng/μl，再分别将2 μl稀释好的DNA标准品加入不同的200 μl染料工作液中。Qubit核酸测定仪的DNA浓度标曲是两点定标法，即只需要加入1个空白 (不加DNA的染料工作液) 和1个最高浓度标准品，由于不确定样品纯化后的DNA浓度，所以可以先用50 ng/μl浓度标准品做标曲，随机测定几个样品，根据结果调整高浓度标准品的浓度后再重新做标曲。
   5.3

   测定完一个库的30个样品的DNA浓度之后，若库中样品最低浓度小于4 ng/μl，需要将相应低浓度的样品重新进行PCR扩增与纯化后，再定量。混库标准为：每个样品的DNA总量=最低浓度样品的DNA浓度 × 其样品体积 (按14 μl算)。然后浓度最低样品的混库体积为14 μl，剩余样品的混库体积为DNA总量÷样品的DNA浓度，将所有样品按上述计算的体积加入到一个新的无菌1.5 ml离心管中，在离心管盖和离心管壁上做好双重标记。
6. DNA测序策略
   根据PCR产物 (目标DNA片段) 的大小，选择合适的测序策略进行高通量测序。如果DNA片段全长小于280 bp，选用二代Illumina PE150测 序；如果DNA片段大于280 bp、小于480 bp，选用二代Illumina PE250测序；如果DNA片段大于480 bp小于580 bp，建议选用二代 Illumina PE300测序；如果PCR产物大于580 bp，建议选用三代PacBio测序。
   

致谢

本研究获得国家自然科学基金 (91851104)、厦门市科技计划项目(3502Z20203077)、科技部国家科技基础资源调查专项 (2017FY100300) 的资助。

参考文献

1. Liu, M., Liu, L. M., Chen, H. H. Yu, Z., Yang, J. R., Xue, Y. Y., Huang, B. Q. and Yang, J. (2019). Community dynamics of free-living and particle-attached bacteria following a reservoir Microcystis bloom. Sci Total Environ 660: 501–511.
2. Liu, L. M., Yang, J., Yu, Z. and Wilkinson, D. M. (2015). The biogeography of abundant and rare bacterioplankton in the lakes and reservoirs of China. ISME J 9: 2068–2077.