摘要:浮游细菌是水生态系统的重要组成部分,利用DNA分子手段可对水体环境样品中的浮游细菌种类、丰度、多样性与群落组成进行检测。本方法基于水体环境样品的总基因组DNA,或者提取总RNA后逆转录的cDNA,选择合适的标记基因 (主要是16S rRNA基因的可变区) 进行PCR扩增,将扩增产物构建测序文库,后续可利用Illumina高通量测序技术进行测序。该方法可以快速、高效、大量地获取水体环境中浮游细菌的标记基因序列,随后进行序列的质量控制和数据库比对,确定这些序列对应的分类单元信息,获得浮游细菌群落信息。
关键词: 水体环境, 浮游细菌, 群落组成, 建库, 高通量测序
材料与试剂
- 移液器吸头、离心管
- 96孔板和封板膜 (Roche, LightCycler 480 Multiwell Plate 96)
- DNA提取试剂盒 (MP Biomedicals, FastDNA Spin Kit)
- 高保真PCR酶试剂 (New England Biolabs, Phusion High-Fidelity PCR Master Mix)
- 电泳上样缓冲液Loading buffer (Takara, 6× Loading Buffer, Cat. No. 9156)
- 琼脂糖粉末 (Sigma, A9539-250G)
- TAE溶液 (Solarbio, 50× TAE)
- DNA Marker (New England Biolabs, 50 bp DNA Ladder, NEB #B7025)
- 凝胶纯化试剂盒 (南京诺唯赞, DC301-01)
- Qubit分子定量试剂盒 (Promega, QuantiFlour dsDNA System)
仪器设备
- 移液器 (Eppendorf, 100–1000 μl, 10–100 μl 20–200 μl, 2–20 μl, 0.5–10 μl, 0.1–2.5 μl)
- 均质仪 (杭州奥盛, Bioprep-24)
- 离心机 (Eppendorf, 5417R)
- 干式加热器 (Labnet, D1100-230V)
- 超净工作台 (苏净安泰, Airtech)
- 漩涡混合器 (海门其林贝尔, Vortex-6)
- 200 μl八联移液器 (Brand, 10-200 μl)
- 96孔板离心机 (杭州奥盛, Mini-P25)
- PCR热循环仪 (Bio-Rad, S1000)
- 电泳仪 (北京六一, DYY6C)
- 电泳槽 (北京六一, JYCP31DN)
- 凝胶成像仪 (上海培清, JS-680B)
- 核酸测定仪 (ThermoFisher, Qubit 4.0)
实验步骤
- 水体环境样品DNA提取
- 浮游细菌的PCR扩增
- PCR结果的电泳检测
- PCR目标条带回收纯化
- 纯化DNA浓度测定及混库
- DNA测序策略
根据PCR产物 (目标DNA片段) 的大小,选择合适的测序策略进行高通量测序。如果DNA片段全长小于280 bp,选用二代Illumina PE150测 序;如果DNA片段大于280 bp、小于480 bp,选用二代Illumina PE250测序;如果DNA片段大于480 bp小于580 bp,建议选用二代 Illumina PE300测序;如果PCR产物大于580 bp,建议选用三代PacBio测序。
致谢
本研究获得国家自然科学基金 (91851104)、厦门市科技计划项目(3502Z20203077)、科技部国家科技基础资源调查专项 (2017FY100300) 的资助。
参考文献
- Liu, M., Liu, L. M., Chen, H. H. Yu, Z., Yang, J. R., Xue, Y. Y., Huang, B. Q. and Yang, J. (2019). Community dynamics of free-living and particle-attached bacteria following a reservoir Microcystis bloom. Sci Total Environ 660: 501–511.
- Liu, L. M., Yang, J., Yu, Z. and Wilkinson, D. M. (2015). The biogeography of abundant and rare bacterioplankton in the lakes and reservoirs of China. ISME J 9: 2068–2077.
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:肖鹏, 续子杰, 杨军. (2021). 基于DNA宏条形码的水体浮游细菌群落测序建库方法. // 微生物组实验手册.
Bio-101: e2003739. DOI:
10.21769/BioProtoc.2003739.
How to cite: Xiao, P., Xu, Z. J. and Yang, J. (2021). Library Construction for DNA Metabarcoding of Bacterioplankton Communities in Waters. // Microbiome Protocols eBook.
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10.21769/BioProtoc.2003739.