利用GeoChip分析环境微生物功能基因群落结构
Analysis of Microbial Functional Gene Community Structure in Environmental Samples by GeoChip   

材料与试剂

1. 各种型号枪头
2. 离心管
3. PCR管
4. DNA 样品 (或cDNA)
5. 随机引物Random primer (3 μg/μl random hexamers; Life Technologies,)
6. dNTP (5 mM dAGC-TP, 2.5 mM dTTP; GE Healthcare )
7. CyDye (25 nM Cy-3 dUTP; GE Healthcare)
8. Klenow (imer; 40 U·ml-1; San Diego, CA)
9. Klenow buffer (San Diego, CA)
10. 双蒸水H₂O
11. Qiagen QIAquick Kit试剂盒
12. 2× HI-RPM hybridization buffer (Thermo Fisher Scientific, USA)
13. 10× Acgh Blocking Agent (Thermo Fisher Scientific, USA)
14. Formamide (Thermo Fisher Scientific, USA)
15. Cot-1 DNA (Thermo Fisher Scientific, USA)
16. Universal standard (home-made common oligonucleotide reference standard)
17. Wash Buffer 1 (Agilent)
18. Wash Buffer 2 (Agilent)
    

仪器设备

1. GeoChip5.0芯片 (180K或者60K)
2. 涡旋仪
3. 小离心机
4. PCR 仪
5. 离心机 (配备1.5 ml 转头)
6. 恒温水浴锅
7. 金属浴恒温仪
8. 移液器
9. Nanodrop核酸检测仪
10. 真空浓缩仪 (Speed Vac；ThermoSavant)
11. 恒温箱
12. 分子杂交炉 (Shel labs G2545A)
13. Agilent SureHyb组件
14. 芯片扫描仪NimbleGen MS200 Microarray Scanner (Roche NimbleGen, Madison, WI, USA).
15. 磁力搅拌器

实验步骤

1. DNA荧光标记
   1.1

   按照如下表1配置DNA/随机引物混合体系 (35 µl)，并分装于PCR反应管。
   
   表1. DNA/随机引物混合体系配置
   
   
   
   1.2

   在制备DNA荧光标记时，一般需要500-1000 ng DNA样品，可以根据样品DNA浓度利用双蒸水 (H2O) 将体系调整至35 µl。
   1.3

   利用振荡器充分混匀DNA/随机引物混合体系，利用PCR仪进行99.9 °C温育5 min，而后立即置于冰上冷却。
   1.4

   按照如下表2配置荧光标记预混合液体系。
   
   表2. 荧光标记预混合液体系配置合体系配置
   
   *荧光染料CyDye是光敏感性试剂，因而配置过程需要在暗室中完成。
   
   
   1.5

   将15 µl荧光标记预混合液加入到冷却的DNA/随机引物混合液中混合均匀，利用PCR仪37 °C温育6 h，95 °C热激灭活酶反应3 min，并立即4 °C冷却终止反应。
   1.6

   利用Qiagen QIAquick Kit试剂盒严格按照产品说明对荧光标记DNA样品进行纯化，用100 µl H2O或者 EB溶液洗脱回收DNA样品 (卢慧, 2013)。
   1.7

   利用Nanodrop测定荧光染料CyDye标记效率，效率最低应> 50 pmol (例如，纯化DNA被100 µl EB溶液洗脱回收并且Nanodrop测定为0.8 pmol/µl; 100 × 0.8 = 80，因而荧光标记效率合格，可以用于芯片杂交)。
   1.8

   设置真空浓缩仪 (Speed Vac) 温度45 °C，运行时间 2 h，真空等级 (Vacuum level) 5.1，对荧光标记DNA样品进行彻底干燥。
2. GeoChip芯片杂交
   2.1

   利用27.5 µl双蒸水重新溶解荧光标记DNA样品，简短震荡并离心收集溶液于离心管底部。
   2.2

   目前最新版GeoChip 5.0有180K和60K两个版本 (He et al., 2007; Tu et al., 2015; Shi et al., 2019)，按照如下表3配置杂交预混合液体系用于180K或60K版本GeoChip杂交分析。
   
   表3. 杂交预混合液体系配置
   
   
   
   2.3

   将配置好的杂交预混合液加入到溶解的荧光标记DNA样品中，手指轻弹15 s并离心收集于离心管底部。
   2.4

   利用金属浴恒温仪95 °C温育3 min使得DNA变性，并立即转移至37 °C恒温箱中温育30 min。
   2.5

   37 °C条件下6,000 × g离心1 min，并立即放回37 °C恒温箱中。
   2.6

   检查分子杂交炉设置温度为67 °C，转速20 rpm。
   2.7

   将一个垫圈玻片装入Agilent SureHyb组件底座上，标签正面为"Agilent"向上。
   2.8

   吸取112 µl (180K) 或者50 µl (60K) 杂交混合液，转移其中~110 µl (180K) 或~48 µl (60K) 至垫圈玻片中心部位，避免液体接触边缘垫圈和产生气泡。
   2.9

   将标签为"Agilent"的微阵列GeoChip玻片轻轻覆盖在垫圈玻片上，数字条码面朝上，避免GeoChip玻片于杂交混合液接触时产生气泡。
   2.10

   将Agilent SureHyb腔盖轻轻置于GeoChip玻片上，并将夹具组件滑动到底座和腔件中间，用手将夹具组件螺丝牢牢地拧紧，固定底座和腔盖。
   2.11

   垂直旋转组装腔体，确保垫圈内杂交液体没有气泡或者气泡可以随液体平稳移动 (如有必要，在桌面上轻击组件以移动固定的气泡)。
   2.12

   将Agilent SureHyb组件放置于分子杂交炉中杂交22-24 h，保证旋转平衡。
   2.13

   将200 ml Wash Buffer 2在43 °C水浴锅中温育过夜。
   2.14

   按照如下三个步骤对芯片进行清洗：
   
   
   
   
   2.15

   在清洗过程中尽量避免拆解后的GeoChip玻片暴露于空气中，避免玻片置于清洗液过程中形成气泡，同时保证只触摸GeoChip玻片的条形码部位或边缘。
3. GeoChip芯片扫描和数据分析
   3.1

   将GeoChip芯片插入到芯片扫描仪 (NimbleGen MS200 Microarray Scanner) 的载玻片架中，保证标签为"Agilent"一面向上，条形码一端在外侧。
   3.2

   利用 Multi-TIFF模式对芯片进行扫描，生成图片格式数据 (图1)。
   3.3

   利用Agilent芯片读取转化软件 (Agilent Feature Extraction program, v11.5) 将图片文件转化为文本数据文件，并将数据上传至GeoChip分析网站 (http://ieg.ou.edu/microarray/) 对数据进行标准化 (Zhou et al., 2011; 谢建平，2011; Guo et al., 2020) 和后续统计分析。
   
   
   图1. GeoChip芯片扫描生成结果示意图 正常清洗后GeoChip芯片扫描整体 (a) 和局部 (b) 放大效果示意图；毛絮污染后GeoChip芯片扫描整体 (c) 和局部 (d) 放大效果示意图
   
   

注意事项

1. DNA样品的质量对于荧光标记、芯片杂交和最终的数据质量影响很大，因此尽可能得到高质量的DNA样品是GeoChip芯片分析最关键的第一步。
2. 实验过程中用到的荧光染料对光比较敏感，在有条件的情况下尽可能做到避光或者所有实验过程都在暗室中进行。
3. 实验过程涉及药品试剂较多，芯片杂交对温度等环境条件比较敏感，为避免批次效应尽量将所有样品在一批或者短时间内处理完成。
4. 空气中悬浮颗粒和细小毛絮沾染在清洗后的GeoChip芯片上对后续芯片扫描影响较大 (图1)，因而应尽量保证实验环境的清洁。
   

致谢

本项目由国家自然科学基金项目 (编号：41907209) 和中国博士后科学基金项目 (编号：2018M641327、2019T120101) [Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 41907209), the China Postdoctoral Science Foundation (2018M641327 and 2019T120101)] 支持。

参考文献

1. Guo, X., Gao, Q., Yuan, M., Wang, G., Zhou, X., Feng, J., Shi, Z., Hale, L., Wu, L., Zhou, A., Tian, R., Liu, F., Wu, B., Chen, L., Jung, C. G., Niu, S., Li, D., Xu, X., Jiang, L., Escalas, A., Wu, L., He, Z., Van Nostrand, J. D., Ning, D., Liu, X., Yang, Y., Schuur, E. A. G., Konstantinidis, K. T., Cole, J. R., Penton, C. R., Luo, Y., Tiedje, J. M. and Zhou, J. (2020). Gene-informed decomposition model predicts lower soil carbon loss due to persistent microbial adaptation to warming.Nat Commun 11(1): 4897.
2. He, Z., Gentry, T. J., Schadt, C. W., Wu, L., Liebich, J., Chong, S. C., Huang, Z., Wu, W., Gu, B., Jardine, P., Criddle, C. and Zhou, J. (2007). GeoChip: a comprehensive microarray for investigating biogeochemical, ecological and environmental processes. ISME J 1(1): 67-77.
3. Shi, Z., Yin, H., Nostrand, J. D. V., Voordeckers, J. W., Tu, Q., Deng, Y., Yuan, M., Zhou, A., Zhang, P., Xiao, N., Ning, D., He, Z., Wu, L. and Zhou, J. (2019). Functional gene array-based ultrasensitive and quantitative detection of microbial populations in complex communities. mSystems 4: e00296–00219.
4. Tu, Q., Yu, H., He, Z., Deng, Y., Wu, L., Van Nostrand, J. D., Zhou, A., Voordeckers, J., Lee, Y. J., Qin, Y, Hemme, C. L., Shi, Z., Xue, K., Yuan, T., Wang, A. and Zhou, J. (2015). GeoChip 4: a functional gene-array-based high-throughput environmental technology for microbial community analysis. Mol Ecol Resour 14(5): 914-928.
5. Zhou, J. Z., Xue, K., Xie, J. P., Deng, Y., Wu, L. Y., Cheng, X. L., Fei, S. F., Deng, S. P., He, Z. L., Van Nostran, J. D. and Luo, Y. Q. (2011). Microbial mediation of carbon-cycle feedbacks to climate warming. Nature Clim Change 2(2): 106-110.
6. 卢慧. (2013). 三江源典型高寒草甸不同海拔梯度土壤微生物研究. 硕士学位论文. 青海师范大学
7. 谢建平. (2011). 功能基因芯片 (GeoChip) 在两种典型环境微生物群落分析中应用 的研究. 博士学位论文. 中南大学