牧草种子内生真菌的分离、鉴定与保存方法
Isolation, Identification and Preservation of Endophytic Fungi from Forage Seeds   

材料与试剂

1. 培养皿
2. 封口膜
3. 滤纸
4. 披碱草种子
5. 无水乙醇 (国药集团，catalog number: 64-17-5)
6. 次氯酸钠 (国药集团，catalog number: 7681-82-9)
7. 硫酸链霉素 (沃凯，catalog number: 3810-74-0)
8. 甘油 (国药集团，catalog number: 56-81-5)
9. 真菌基因组DNA提取试剂盒 (北京索莱宝科技有限公司D2300)
10. PDA培养基 (美国BD DIFCO，BD 213400)
    

仪器设备

1. 手术刀
2. 镊子
3. 接种针
4. 分析天平 (METTLER TOLEDO，PG5001-S)
5. 高压蒸汽灭菌器 (TOMY，SX-700)
6. 超净工作台 (HITACHI，PCV clean bench)
7. 恒温培养箱 (宁波江南仪器厂，DNP-9082)
8. 光学显微镜 (OLYMPUS，BX51)
   

软件和数据库

NCBI中的Nucleotide BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROG-RAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)

实验步骤

一、牧草种子内生真菌的分离及培养

1. 牧草种子种内生真菌的分离方法
   选取干净、颗粒饱满的表面无任何病症的牧草种子足量，然后小心剥去种子的外皮，在超净工作台进行常规的消毒灭菌步骤。具体操作如下：将去皮的牧草种子用无菌水清洗3次，95%乙醇40 s，无菌水冲洗1次，5%次氯酸钠溶液1 min，无菌水冲洗5次，然后将经过表面消毒灭菌的种子置于无菌滤纸上用解剖刀将种子切为3~4小段，放入PDA平面培养基中分离内生真菌，并将种子横切面与培养基充分接触，每个培养皿中放入4~5个种子段，然后用封口膜封好。表面消毒效果检测采用漂洗检验法，吸取最后一次漂洗种子的无菌水200 µl均匀涂布于PDA培养基上作为阴性对照。
   
2. 牧草种子内生真菌的培养方法
   把封口的培养基放入28 °C恒温培养箱中培养3~7天，期间观察对照培养基是否有菌落长出，观察PDA培养基种子周围长出的真菌，及时在超净工作台中挑取单一菌种菌丝转移到新的PDA培养基，以防被后面分离到的真菌覆盖。经过上述分离程序得到的内生真菌分别用接种针挑取单一菌丝转移到新的不含硫酸链霉素的PDA培养基上，置于28 °C恒温培养箱。观察菌落生长特征，分别为分离到的内生真菌编号命名、拍照记录菌落形态。
   

二、牧草种子内生真菌的鉴定及保存方法

1. 牧草种子内生真菌的鉴定方法
   内生真菌的鉴定采用菌落形态学鉴定与ITS序列测序相结合的方法鉴定，其中内生真菌的形态学鉴定是通过PDA平板28 °C恒温培养7天，观察内生真菌的色泽、质地和生长速率等基本菌落形态特征。将灭菌的载玻片放入培养皿中，高压灭菌后的PDA 培养基轻轻倒于载玻片上形成一层薄薄的培养层，分离的内生真菌分别接种于载玻片，28 °C恒温培养5~7天，于光学显微镜下观察其菌丝生长形态以及是否产孢子，并选取典型生长特征的视野拍照记录。参考《真菌鉴定手册》及其他参考文献进行内生真菌形态的初步鉴定 (魏景超, 1979)。
   ITS序列测序方法是目前最常见的分子鉴定内生真菌的方法，据报道，ITS序列分析在不产孢真菌鉴定中特别有效，减少了偏倚判断的影响 (Nair and Padmavathy, 2014)。刮取适量PDA平板上培养一周的内生真菌菌丝体，根据真菌基因组DNA提取试剂盒说明书，提取分离到的内生真菌的基因组DNA。用ITS通用引物扩增内生真菌的ITS片段序列 (T. J. White, 1990)。PCR产物的检测、回收纯化和测序由上海美吉生物公司完成。测序结果在NCBI数据库中进行Nucleotide BLAST同源性序列比对。根据BLAST比对结果选择identity高即序列相似性较高的序列，用MEGA6.0软件构建系统进化树。采用neighbor-joining法，bootstrap value设置为1000。通过系统进化发育相似性以及GenBank序列相似性结合菌落形态学确定内生真菌的分类地位。
   
2. 牧草种子内生真菌的保存方法
   所有分离的内生真菌分别命名后将其保存于实验室。短期保存方法：将纯化后的内生真菌用接种针接种于PDA斜面培养基，28 °C恒温培养箱培养7天，观察菌落形态与平面培养基一致且无杂菌污染后，置于4 °C冰箱中保存。长期保存方法：将以上对应的内生真菌的菌丝块置于25%甘油中，-80 °C超低温冰箱保存。
   

溶液配方

1. 内生真菌的分离培养基
   PDA平面培养基 (加0.50 g/L的硫酸链霉素用于抑制细菌的生长)。称取39 g PDA 培养基，溶于1,000 ml蒸馏水中，121 °C高压蒸汽灭菌20 min后，待培养基冷却到手摸不烫的程度，将事先用0.22 μm过滤器过滤的0.50 g/L硫酸链霉素加入到培养基中，摇晃均匀，制作PDA平面和斜面培养基。
   
2. 25%甘油的配制
   将25 ml甘油试剂溶于100 ml蒸馏水中，121 °C高压蒸汽灭菌20 min后，于常温下保存，一般现配现用。
   
3. ITS片段扩增所用引物
   ITS1：3′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-5′
   ITS4：3′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-5′
   
4. 内生真菌ITS片段序列扩增PCR体系
   
   表1. PCR扩增体系
   
   


5. PCR扩增程序
   
   

致谢

本实验方法的完成得到“中央级公益性科研院所基本科研业务费专项 (1610332020014)”的资助。采用本实验方法发表的文章如下：Qiang, X. J., Ding, J. J., Lin, W., Li, Q. Z., Xu, C. Y., Zheng, Q. and Li, Y. Z. (2019). Alleviation of the detrimental effect of water deficit on wheat (Triticum aestivum L.) growth by an indole acetic acid-producing endophytic fungus. Plant and Soil 439(1-2): 373-391.
本实验方法改编自强晓晶博士毕业论文《披碱草内生真菌对小麦抗旱性的影响机制》，在此感谢博士毕业课题为本实验方法的完成提供了良好的基础。

参考文献

1. Wei, J. C. (1979). Fungus Identification Manual. Science and Technology Pub. House, Shanghai. ISBN: 13119-718. (in Chinese)
2. Nair, D. N. and Padmavathy, S. (2014). Impact of endophytic microorganisms on plants, environment and humans. Sci World J 2014: 250693.
3. White, T. J., Bruns, T., Lee, S. and Taylor, J.W. (1990).Chap. 1: Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J. and White, T. J. (Eds.). In: PCR Protocols. Academic Press, Inc., 315-322.