海洋沉积物样品细胞提取及荧光显微镜计数法
Cell Extraction of Sediment Samples and Fluorescence Microscope Counting Method   

材料与试剂

1. 离心管 (2ml, Axygen, USA, catalog number: MCT-200-C)
2. 0.22 μm聚碳酸纤维膜 (GTBP) (Millipore, Billerica, MA, USA, catalog number: GTBP02500)
3. 滤膜衬垫纸 (Whatman, Grade GF/C：1.2µm, catalog number: 1822-055)
4. 0.22 μm针式过滤器 (Millipore, Millex-GP, catalog number: SLGPR33RB)
5. 多聚甲醛 (上海泰坦科技有限公司，catalog number: 410730010)
6. NaCl (国药集团化学试剂有限公司，catalog number: S9625-500G)
7. 10x磷酸缓冲盐溶液 (10x PBS溶液，pH =7.4，Sigma, catalog number: P5368)
8. 乙酸钠 (Sigma, catalog number: S5636)
9. 乙酸 (Sigma, catalog number: A6283)
10. Nycodenz (Axis-Shield, catalog number: 1002424)
11. SYBR Green I 核酸染料10,000× 浓缩液 (InvitrogenTM, catalog number: S7563)
12. 甘油 (国药集团化学试剂有限公司，catalog number: G7757-500ML)
13. 甲醇 (国药集团化学试剂有限公司，catalog number: 179957-1L)
14. 0.5 M乙二胺四乙酸二钠溶液 (北京索莱宝科技有限公司，catalog number: E1170)
15. 十水焦磷酸钠 (国药集团化学试剂有限公司，catalog number: 205975000)
16. 吐温80 (国药集团化学试剂有限公司，catalog number: 278632500)
17. 肖特瓶 (100ml，Schott，catalog number：21801245)
18. 聚醚砜布氏漏斗 (25 mm，50 ml，PALL，catalog number: 4204)
19. 橡胶塞 (直径适配抽滤瓶，成阳公司，catalog number: 10025574028902)
20. 抽滤瓶 (GG-17，蜀牛玻璃抽滤瓶500 ml，catalog number: 45264074266)
21. 耐高温磁性搅拌子
22. 沉积物细胞固定液 (见溶液配方)
23. 醋酸缓冲液 (pH = 4.6) (见溶液配方)
24. 含3% NaCl的磷酸缓冲盐溶液 (见溶液配方)
25. 1x磷酸盐缓冲液 (见溶液配方)
26. 去污剂混合液 (见溶液配方)
27. Nycodenz密度梯度溶液 (见溶液配方)
28. 100x SYBR Green I染液 (见溶液配方)
29. 50%甘油 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 离心机 (Eppendorf 5430，德国，Eppendorf)
2. 涡旋仪 (Vortex Genie^® 2 Vortex，美国，MO BIO)
3. 移液枪 (10 μl, 200 μl, 1 ml，德国，Eppendorf)
4. 高压灭菌锅 (G154DWS，中国，致微仪器有限公司)
5. Nikon ECLIPSE 90i全自动科研级显微镜 (ECLIPSE 90i，日本，Nikon)
6. 荧光滤光块（FITC, Texas Red, 具体参数详见备注，日本，Nikon）
7. 真空泵 (津腾GM-0.5B，中国，津腾公司)
8. 超声波破碎仪 (Thermofisher, FB50220，美国，Thermofisher)
9. 电磁加热搅拌器 (TH-500，中国，上海沪西分析仪器厂)
   

荧光滤光块备注：

实验基本原理

海洋沉积物中含有大量的矿物和有机质颗粒，而微生物会附着在这些颗粒物的表面或者被这些颗粒物包裹。这会阻碍我们对沉积物中微生物多样性和生态功能的研究。本方法主要利用化学试剂溶解颗粒物，并结合超声破碎和密度梯度离心使细胞和颗粒物分离，最后收集细胞。基本原理如下：

1. 甲醛溶液固定细胞：甲醛可以迅速与细胞中氨基酸结合，并逐渐使蛋白质交联，致使细胞失活且内容物被包裹在交联的蛋白质网络内，起到固定细胞的作用。
2. 化学试剂剥离细胞：沉积物颗粒物中含有大量的碳酸盐和矿物质，化学法是利用乙酸溶解碳酸盐使附着在碳酸盐颗粒上的细胞脱离、加入甲醇和去污剂溶液 (吐温和焦磷酸) 有助于有机质 (蛋白质) 颗粒的解聚和溶解、EDTA可以螯和金属离子，改变矿物对细胞的吸附。
3. 超声剥离细胞：利用物质性质的差异，细胞与颗粒物在超声处理下震动频率不同，细胞与颗粒物的结合得以松散开来。
4. 密度梯度离心：可以利用不同浓度的Nycodenz溶液配制成密度梯度，通过离心，使得不同密度的细胞分布在不同的密度梯度中，大颗粒沉降到管底。同时，由于颗粒物在沉降过程中会在其后端引发湍流并拖拽附近细胞沉降，而越低的雷诺数越不易引发湍流。溶液粘度越高，雷诺数越低。因此，通过逐步提高溶液密度与粘度，离心管内湍流的形成会被显著抑制，最终将大部分细胞保留于密度梯度溶液中。
5. 荧光染色：荧光染色是通过SYBR Green I染液，是一种能够结合双链DNA双螺旋小沟区域的发射峰位于绿光区域的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但是与双链DNA结合后，荧光强度大大增强。可以通过荧光显微镜观察到荧光信号。
   
   
   图 1. 海洋沉积物中微生物细胞荧光染色图片
   
   

实验步骤

一、实验器材灭菌

1. 滤膜衬垫纸放入超净台，打开紫外灯杀菌30 min。布氏漏斗，胶塞和抽滤瓶121 °C高压灭菌20 min，然后烘干使用。
2. 需有阴性对照确保各环节试剂无污染。用与样品等体积的无菌水作为对照，所有步骤与样品处理步骤相同，最后荧光显微镜观察，并细胞计数。确保在随机挑选的16个视野中没有染色的微生物细胞。
   

二、样品处理

1. 取一定体积的沉积物样品，用沉积物细胞固定液，以1:5 (体积比例，样品1体积，固定液5体积) 的比例稀释并固定样品，用涡旋仪 (Vortex) 混匀；4 °C保存20 min，然后取100 μl固定样品，装入2 ml离心管进行细胞提取 (可以多做几个平行样品)。
2. 在超净台中，向100 μl的稀释样品中加入500 μl醋酸缓冲液 (pH = 4.6)，盖上管盖，放在室温下反应两小时，每半小时开一次管盖，以排出CO₂。
3. 3,000 × g离心10 min，离心结束后，将上清转移到干净的2 ml离心管中，收集待测（视频1）。
   
   
   
   Video 1. 转移细胞悬液
   
   
4. 上述步骤离心后的沉淀即为除碳酸盐后的沉积物，向该沉淀中加入400 μl 含有3.5% (w/v) NaCl的PBS溶液，重新悬浮沉淀，并加入50 μl的去污剂混合液和50 μl的甲醇，轻柔混匀溶液，室温反应3-5 min。
5. 用注射器在样品悬液底部分别依次缓慢加入500 μl 30%、50%和80% (w/v) Nycodenz溶液 (视频2)。
   
   
   
   Video 2. 制备密度梯度Nycodenz溶液
   
   
6. 3,000 × g离心10 min，从表面吸取上清溶液，避免吸取到沉淀，将所有上清溶液转移至干净的离心管内，收集待测。
   注：不要跟第3步的上清液放在一个管内，否则EDTA会和Ca离子螯合，产生沉淀。
7. 用400 μl 3.5% NaCl的PBS溶液将管内沉淀重悬，并加入去污剂混合液和甲醇各50 μl。
8. 将步骤7中装有沉淀混合溶液的2ml离心管置于冰水混合物上，超声波探头插入冰水下3 cm并距离离心管5 cm，15 W超声，每次10 s，间隔20 s，一共5次 (超声波探头放置位置见视频3)。
   
   
   
   Video 3. 超声法解离细胞颗粒物聚合体
   
   
   
9. 重复第5-6两步 (加Nycodenz，离心，取上清)，将上清液装入无菌离心管中，收集待测。
10. 将上述获得的三部分上清液过滤到0.22 μm滤膜上：先用无菌水润洗漏斗两次，垫上滤膜衬垫纸，用无菌水润湿，启动真空泵将纸垫吸附在漏斗上，垫上滤膜，滤膜边缘要与滤器口对齐，拧紧漏斗，加入5 ml 3.5% NaCl的1x PBS溶液，静置2-3 min检测是否漏液。如果不漏液的话，再加入上清液，缓慢吹打几次、搅匀后再启动真空泵抽滤，以保证所有细胞在膜上分布均匀。若漏液，重新组装各部分并再次检验是否漏液。
11. 在超净台内，将滤膜放置在无菌培养皿上，用移液器吸取100 μl 100x SYBR Green I染液均匀滴加在滤膜上，避光染色30 min后，用无菌滤纸，放在滤膜边缘吸干多余的染液。
12. 加入40 μl 50%的甘油作为防淬灭剂和折光介质覆盖在滤膜上，压上盖玻片，除去气泡，用荧光显微镜检测。
13. 开启荧光显微镜，将载玻片放在显微镜的载物台上固定，10倍镜粗调焦距，40倍镜下细调焦距，在明场下观察滤膜至能清晰分辨滤膜表面的纹理，表明 此时焦平面已调节至滤膜表面附近，找到目标视野，在盖玻片上滴少量镜油，再放入载物台上，转换成油镜，并切换显微镜至荧光观察模式，选择荧光通 道FITC滤光块。样品中微生物细胞应呈明亮绿色荧光，且形态符合微生物细胞形状。沉积物中部分杂质也会吸附荧光分子并呈现类似荧光信号，可以转换荧光信号到Tex red荧光通道,如果颗粒仍旧有红光，有可能是沉积物颗粒，而非细胞，应小心分辨。
14. 观察并拍照，保存合适的图片用于细胞计数。
15. 观察和拍照结束后，关闭所有电源，用二甲苯擦拭油镜物镜端镜头，将载物台调整至原始位置，换镜转盘转换到空镜头位。
16. 细胞计数：对于每个滤膜，随机挑选16个目镜视野，拍照后统计视野中微生物总 数a。每个样品应有数个平行组过滤在相应数量b的滤膜上。为使结果可信，应满足 > 1000 (个)。
17. 估算每张滤膜上的微生物总数。其中，m为视野面积，a为该滤膜上16个视野中微生物总数，d为漏斗接触滤膜处内径。估算原始样品中微生物数量x = c/bV，其中，V为计算得到的过滤至单一滤膜上的原始样品体积，b为平行组数量。
    

溶液配方

1. 沉积物细胞固定液 (4% (w/v) 多聚甲醛溶液)
   在通风橱内称取 4 g多聚甲醛，0.1 g氢氧化钠，以及2 g氯化钠，加入到90 ml 1x PBS缓冲液中，放入磁力搅拌子，在磁力搅拌器上溶解。待白色颗粒完全溶解后，用1 M 盐酸溶液调节pH为7.0左右并补充1x PBS至100 ml，然后用0.22 μm无菌的针式过滤器过滤到无菌玻璃瓶内，4 °C保存。
   
2. 1x磷酸盐缓冲液 (phosphate buffer saline，PBS)
   取100 ml 10x磷酸盐缓冲液 (pH = 7.4)，加入到800 ml无菌去离子水中，反复颠倒几次混匀，用无菌去离子水定容至1000 ml，121 °C高压灭菌20 min，冷却至室温待用。
   
3. 含有3.5% NaCl的PBS溶液
   称取3.5 g NaCl，加入到100 ml 1x PBS溶液中混匀，121 °C高压灭菌20 min，冷却至室温待用。
   
4. 醋酸缓冲液(pH = 4.6)
   量取2 ml乙酸，称取3.5 g 醋酸钠和3.3 g NaCl，加入到80 ml去离子水中，再加入5 ml 40%甲醛溶液混合均匀，定容至100 ml，用稀盐酸调节溶液pH = 4.6，用0.1 μm无菌滤膜过滤至无菌的玻璃瓶中，室温保存。
   
5. 去污剂混合液
   量取0.5 M 乙二胺四乙酸钠溶液 (Ethylene Diamine Tetra acetic Acid，EDTA，pH 8.0) 2 ml，称取焦磷酸钠 0.266 g加入到EDTA中，再吸取0.1 ml 吐温-80 (Tween 80) 加入到溶液中，补充去离子水至10 ml。用0.22 μm无菌针式过滤器过滤至无菌的玻璃瓶中，避光室温保存。
   
6. 梯度密度Nycodenz溶液
   称取30 g，50 g和80 g Nycodenz粉末，分别加入到80 ml去离子水中，并用去离子水定容至100 ml，配制成质量体积分数分别为30%、50%和80% (w/v) 的Nycodenz 水溶液。然后使用无菌的针式过滤器过滤灭菌，并收集在避光的无菌离心管中，4 °C保存。
   
7. 100x SYBR Green I染液
   避光环境下，在超净台中用移液器吸取10 μl SYBR Green I 10,000x原液，加入到装有990 μl无菌去离子水的2 ml离心管中，离心管外壁包上铝箔避光，在vortex上混匀1 min，4 °C保存。
   
8. 50%甘油
   量取50 ml甘油，加入50 ml去离子水，用0.2 μm无菌滤膜过滤，保存至无菌的玻璃瓶中，室温保存。
   

致谢

本实验方案摘自Jens Kallmeyer和Yuki Morono等人发表的文章New cell extraction procedure applied to deep subsurface sediments: Cell extraction of deep subsurface sediments和An improved cell separation technique for marine subsurface sediments: applications for high-throughput analysis using flow cytometry and cell sorting。

参考文献

1. Kallmeyer, J., Smith, D. C., Spivack, A. J. and D'Hondt, S. (2008). New cell extraction procedure applied to deep subsurface sediments: Cell extraction of deep subsurface sediments. Limnol Oceanogr Meth 6: 236-245.
2. Morono, Y., Terada, T., Kallmeyer, J. and Inagaki, F. (2013). An improved cell separation technique for marine subsurface sediments: applications for high‐throughput analysis using flow cytometry and cell sorting. Environ microbiol, 15(10): 2841-2849.