反刍动物瘤胃原虫与细菌微循环测定方法
Determination of Ruminal Protozoa and Bacteria Recycling   

材料与试剂

1. 2 μm滤膜
2. 80目纱布
3. 无菌生理盐水
4. 5(6)-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素 (DTAF)
5. 无菌瘤胃液 (见溶液配方)
   

仪器设备

1. 载玻片
2. 盖玻片
3. 高速离心机
4. 水浴摇床
5. 荧光显微镜 (Eclipse 80i, Nikon, Japan)
   

实验步骤

1. 采集瘤胃液，经过2 μm滤膜过滤，使用高速离心机于22,000 × g离心15 min (25 °C)，收集沉淀。
2. 收集的沉淀用灭菌生理盐水清洗，使用高速离心机于22,000 × g离心15 min (25 °C)，重复两次，将沉淀物悬浸于灭菌生理盐水中，沉淀物为瘤胃细菌。
3. 将2 mg DTAF加入样品中，荧光染色10 min后，于60 °C水浴培养2 h，然后使用高速离心机于22,000 × g离心15 min (25 °C)，弃上清，沉淀物 使用灭菌生理盐水清洗离心重复三次，将沉淀物悬浸于灭菌生理盐水中，-20 °C 保存。
4. 用时解冻荧光标记细菌，使用高速离心机于22,000 × g离心15 min (25 °C)，收 集沉淀，使用无菌瘤胃液悬浸制成2倍浓度的荧光标记瘤胃细菌 (FLRB) 悬液， 置水浴锅 (39 °C) 备用。
5. 按Menke法[1]进行体外培养。在体外培养进行至10 h时，取与FLRB悬液同体积 的培养液，80目纱布过滤，于150 × g离心10 min (25 °C)，并用无菌生理盐水 洗涤离心2次，用样品一半体积的无菌瘤胃液悬浸，此为原虫悬液。
6. 原虫悬液于水浴摇床振荡培养 (39 °C，厌氧，50 rpm) 30 min重新复苏原虫。
7. 合并原虫悬液和FLRB悬液于水浴摇床振荡培养 (39 °C，厌氧，50 rpm) 进行吞 噬实验，于5、10、15、20、25 min取少量混合培养液滴加到载玻片上，加等体 积甲醛固定，盖上盖玻片马上镜检。
8. 使用荧光显微镜先在普通光100-400倍观察原虫形态，然后在1,000倍油镜下转 置荧光背景，检测原虫体内FLRB数量，每个样品3个重复，每片以12个原虫的平均值计算细菌的吞噬数量。检测原虫体内FLRB数量的荧光图如下图1所示。
   
   
   图1. 原虫吞噬细菌显微镜荧光图 (25 min，400 ×，Bar = 20 μm)
   
   
9. 换算系数：如计算吞噬细菌氮和微生物蛋白含量，可以按如下系数换算。荧光标 记细菌细胞平均体积为0.10 μm³，氮为0.054 pg N/μm³。以吞噬细菌氮量乘6.25的系数来估算微生物蛋白。
     例：如表1 所示，为2-25 min原虫吞噬细菌量，可依此计算吞噬速率、氮量和微生物蛋白量^[2]。
   
   表1. 原虫吞噬细菌相关指标计算举例
   

   时间/min	吞噬量 (cells/cell)	吞噬速率 (cells/(cell h))
   2	18.00	480.00
   5	53.00	636.00
   10	107.00	642.00
   15	137.00	548.00
   20	146.00	438.00
   25	178.00	427.00

   
   对原虫的吞噬量与时间进行25 min内线性回归分析，回归方程为Y = 21.27 + 6.64X (R = 0.971)。式中，Y为原虫吞噬细胞量 (cells/cell)，X为吞噬时间 (min)。由回归直线方程可计算原虫的吞噬速率为398.40 cells/(cell h)。
   荧光标记细菌细胞平均体积为0.10 μm³，氮为0.054 pg N/μm³，则换算氮量为：398.40 × 0.054 × 0.10 = 2.15 pg N/(cell h)，为原虫在内循环中对细菌氮的吞噬速率。若按照山羊瘤胃内容物为 4 L，瘤胃含 5 × 10⁵ 个/ml原虫细胞来计算的话，每头山羊每天因原虫吞噬细菌氮量估计为2.15 × 5 × 10⁵ × 4 × 1000 × 24 × 10^-9 = 103.2 mg N/(d 头)，换算为微生物蛋白量为 103.2 × 6.25 × 10^-3 = 0.645 g Pr/(d 头)。
   

溶液配方

1. 无菌瘤胃液
   采集瘤胃液，于29,000 × g离心20 min (25°C)，取上清液，使用高压蒸汽灭菌器灭菌 (121 °C，0.1 MPa灭菌20 min)，4 °C保存，一周内使用。
   

致谢

感谢国家自然科学基金 (30771567) 对本实验的支持。感谢扬州大学动物科学与技术学院王梦芝所做的研究工作，对本实验提供了很大的帮助。已发表的使用过本实验方案的文章：王梦芝，程欣，谢文文，张柏松，刘翔，王洪荣. (2010). 体外法研究不同油脂对瘤胃原虫吞噬细菌微循环的影响. 中国农业科学 43(18): 3831-3837. 王梦芝. (2008). 山羊瘤胃原虫与细菌吞噬关系和微生物AA变化机制的研究. 博士学位论文. 扬州大学.

参考文献

1. Menke, K. H. and Steingass, H. (1988). Estimation of the energetic feed value obtained from chemical analysis and in vitro gas production using rumen fluid. Anim Res Dev 28: 7-55.
2. 王梦芝. (2008). 山羊瘤胃原虫与细菌吞噬关系和微生物AA变化机制的研究. 博士学位论文. 扬州大学.