实验原理：CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中 (>0.7 mol/L NaCl) 可溶，并可稳定存在。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
实验目的：快速提取植物基因组DNA，可用于PCR检测，对转基因植株进行初步分子鉴定。
关键词: CTAB, DNA小样抽提, PCR
材料与试剂
- 1.5 ml (或2 ml) 离心管
- 水稻叶片
- CTAB (Bio Basic INC., catalog number: GB0308 BJ0011J)
- Tris (进口分装)
- 浓盐酸 (中平能化集团开封东大化工有限公司试剂厂)
- NaCl (国药集团有限公司，分析纯)
- EDTA
- 氯仿 (国药，分析纯)
- 异戊醇 (国药，分析纯)
- 95%乙醇 (国药，分析纯)
- 1.5x CTAB配方 (见溶液配方)
仪器设备
- 离心机 (Sigma, Beckman)
实验步骤
- 取约2 cm长的水稻叶片置于1.5 ml (或2 ml) 离心管中。
- 在研钵中加入800 μl 1.5x CTAB，研磨叶片至匀浆并倒回离心管内。
- 65 °C水浴 20-30 min，每5 min中颠倒混匀一次。
- 用玻璃滴管加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，上下颠倒混匀，持续10 min。
- 10,000 rpm离心10 min。
- 用移液器吸取400 μl上清液至新的离心管，加入2倍体积经冰镇的95%乙醇，-20 °C放置20 min。
- 12,000 rpm离心15 min。
- 弃上清，加入500 μl 75%乙醇，12,000 rpm离心5 min。
- 弃上清，置于超净台吹干或自然晾干后，加100 μl ddH2O溶解。
注意事项
- 水浴颠倒混匀时，注意确认离心管盖是否盖好，避免颠倒时样品泄漏。
- 水浴后开离心管盖子时一定要逐个完全打开，以避免样品间出现交叉污染。
- 用滴管加24:1的氯仿/异戊醇时，由于氯仿具有很强的去除蛋白能力和腐蚀性，可以适当的少加一些（少于样品的体积），一方面减少氯仿使用量(既节省试剂又环保)，另外避免下一步离心过程中导致离心管破裂(尤其是1.5 ml离心管)。
- 吸取上清时注意不要吸到固体残渣或氯仿。
- 如果只需要做阳性检测，可以只吸取300 μl上清液，抽提的DNA就足够后续使用，同时可减少乙醇用量。
溶液配方
- 1.5x CTAB缓冲液配方
CTAB
| 15 g
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1 M Tris-HCl (pH 8.0)
| 75 ml
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0.5 M EDTA (pH 8.0)
| 30 ml
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NaCl
| 61.4 g
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加 ddH2O至
| 1,000 ml
|
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