水稻叶片高质量DNA抽提
High-quality DNA Extraction from Rice Leaves   

材料与试剂

1. 10 ml离心管
   
2. 水稻叶片
   
3. CTAB粉末 (Bio Basic Inc. GB0308BJ011J)
   
4. Tris-HCl, pH 8.0 (进口分装)
   
5. EDTA, pH 8.0 (国药)
   
6. NaCl (国药集团有限公司，分析纯)
   
7. 异戊醇
   
8. 液氮
   
9. 氯仿/异戊醇 (24:1)
   
10. 10% CTAB
    
11. RNase
    
12. 75%乙醇
    
13. 琼脂糖
    
14. 1.5х CTAB (见溶液配方)
    
15. 10% CTAB (见溶液配方)
    
16. 1% CTAB (见溶液配方)
    
17. 氯仿/异戊醇24:1 (体积比) (见溶液配方)
    
18. 1 M NaCl溶液 (见溶液配方)
    
19. TE buffer (见溶液配方)

仪器设备

1. 水浴锅
   
2. 通风橱
   
3. 离心机
   

实验步骤

1. 取1 g生长旺盛的水稻植株叶片，于液氮中迅速研磨成粉。
   注意：请用冰盒取样，如不能立即抽提可保存于-20 °C。建议取样后尽快抽提，避免样品DNA降解。将粉末转移至10 ml离心管中，加入2 ml (枪头需提前划好刻度以免因受热后吸取过量)煮沸的1.5х CTAB (保持高温)。
2. 65 °C温浴30 min。
   
3. 检查样品顺序，在通风橱内加入等体积 (氯仿腐蚀性很强且易挥发，对移液器损害很大，可使用玻璃滴管) 的氯仿/异戊醇 (V/V=24:1)，盖紧管盖，仔细检查保证每个离心管不漏液，轻缓颠倒混匀25 min，3,000 rpm离心15 min。
   
4. 打开管盖，转移上清液于另一10 ml离心管中，加入1/10体积 (约200μl) 的10% CTAB (提前于65 °C温浴)，再加入等体积的氯仿/异戊醇(V/V=24:1)，轻缓颠倒混匀20 min，3,000 rpm离心15 min。
   
5. 用移液器吸上清 (如果使用1 ml的枪头，需提前剪去大约7 mm的枪尖，吸取上清时会更加平缓) 转移到于离心管，加入5 ml 1% CTAB，充分混合均匀后，静置10 min看见离心管中絮状DNA聚集，3,000 rpm离心15 min。
   
6. 弃上清，每管加入1 ml 1 M NaCl溶液和1 µl 100 µg/ml RNase (可根据所需量提前配好Mixture)，65 °C溶解1 d。
   
7. 加入3 ml -20 °C预冷的无水乙醇 (95%乙醇也可)，充分混合均匀后可见絮状DNA沉淀。
   
8. 用枪头将DNA沉淀转至新的1.5 ml离心管中，用75%的乙醇洗涤沉淀，10,000 rpm离心5 min。
   
9. 弃上清，晾干后溶于50 µl-100 µl TE中，溶解至少1周。
   注：如果需要较长时间保存DNA用TE溶解；如果仅较短时间保存DNA可直接用灭菌双蒸水溶解。
   
10. 取1 µl DNA溶液用于0.8%琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNA质量，剩余DNA于-20 °C保存备用。

溶液配方

1. 1.5х CTAB

   15 g	CTAB粉末 (Bio Basic Inc. GB0308BJ011J)
   75 ml	1 M Tris-HCl, pH 8.0 (进口分装)
   30 ml	0.5 M EDTA, pH 8.0 (国药)
   61.4 g	NaCl (国药集团有限公司，分析纯)

   定容1 L，搅拌溶解2 h
   
2. 10% CTAB

   100 g	CTAB粉末
   40.95 g	NaCl

   定容1 L，搅拌溶解过夜，使用前65 °C水浴预热
   
3. 1% CTAB

   10 g	CTAB粉末
   50 ml	1 M Tris-HCl, pH 8.0
   20 ml	0.5 M EDTA, pH 8.0

   定容1 L，搅拌均匀
   
4. 氯仿/异戊醇24:1 (体积比)
   在500 ml氯仿中加入22 ml异戊醇
   
5. 1 M NaCl溶液
   NaCl 58.44 g，加双蒸水溶解，定容1 L，分装后灭菌
   
6. TE buffer

   5 ml	1 M Tris-HCl, pH 8.0
   1 ml	0.5 M EDTA, pH 8.0

   加双蒸水溶解，定容500 ml，分装后灭菌