水稻种子高质量DNA抽提
High-quality DNA Extraction from Rice Seeds   

材料与试剂

1. 2 ml离心管
   
2. 刀片 (切种子)
   
3. 各种型号枪头 (20 μl，200 μl，1 ml)
   
4. 水稻种子
   
5. 液氮
   
6. CTAB (BBI, catalog number: CB0108)
   
7. Tris (BBI, catalog number: TB0194)
   
8. HCl (36-38%，分析纯)
   
9. SDS (BBI, catalog number: SB0485)
   
10. NaCl (BBI, catalog number: SB0476)
    
11. EDTA (Sangon, catalog number: E0105)
    
12. PVP (polyvinylpyrrolidone), Mr40,000
    
13. Proteinase K (Takara, catalog number: D9033)
    
14. NaOH (Sigma, catalog number: S8045)
    
15. Chloroform (国产，分析纯)
    
16. Isoamyl alcohol (国产，分析纯)
    
17. Phenol (Sangon, catalog number: PD0419-3)
    
18. 95% Ethanol (国产，分析纯)
    
19. RNase酶
    
20. Extraction buffer (见溶液配方)
    
21. 2x CTAB solution (见溶液配方)
    
22. 1 M Tris-HCl (pH 8.0) (见溶液配方)
    23.0.5 M EDTA (pH 8.0) (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 研钵
   
2. 移液枪
   
3. 恒温水浴锅
   
4. 冷冻离心机 (Backman)
   

实验步骤

将种子去壳 (如果该种子还要用于发芽，用刀将其从中间切开，分为含胚和不含胚的两部分，含胚的部分用于后续发芽实验，不含胚的部分) 置2 ml离心管中待抽提DNA。

1. 在2 ml离心管中加入400 μl Extraction buffer (含Proteinase K 50 μg)，37 °C孵育1 h。
   
2. 用研钵研磨。
   
3. 加入400 μl (等体积) 2x CTAB solution。
   
4. 加入等体积的酚仿 (氯仿:异戊醇24:1, 5%苯酚)，轻柔摇15 min。
5. 12,000 rpm，4 °C离心10 min，吸取上清至新的1.5 ml离心管。
   
6. 加入2/3体积的异丙醇，室温沉淀10 min (或用2倍体积无水乙醇 -20 °C沉淀1 h以上)。
   
7. 12,000 rpm离心10 min，去上清。
   
8. 70%乙醇，12,000 rpm离心5 min，去上清。
   
9. 吹干后，用含1 μl RNase (10 mg/ml) 的50 μl ddH₂O (或TE) 溶解。
   

结果与分析

得到的DNA可以跑琼脂糖胶检测质量。通常可以得到接近于叶片质量的基因组DNA，可用于PCR检测基因型，或Southern blot (需要≥5粒种子以获得足够的DNA)。

注意事项

Proteinase K和PVP的添加在实验中不可省略，否则有时可能不能抽提到理想质量的基因组DNA。

溶液配方

1. Extraction buffer
   
   
2. 2x CTAB solution
   
   
3. 1 M Tris-HCl (pH 8.0) 50 ml
   用ddH₂O 40 ml溶解Tris 6.057 g，浓HCl调pH至8.0，定容到50 ml。
   
4. 0.5 M EDTA (pH 8.0) 10 ml
   称取1.8612 g EDTA，加8 ml ddH₂O，用固体NaOH调pH至8.0，定容到10 ml。
   

参考文献

1. Kang, H. W., Cho, Y. G., Yoon, U. H. and Eun, M. Y. (1998). A rapid DNA extraction method for RFLP and PCR analysis from a single dry seed. Plant Mol Biol Rep 16: 1-9.