实验原理:Southern印记杂交 (Southern Blotting) 是将植物基因组总DNA酶切,通过琼脂糖凝胶电泳分离,变性之后利用虹吸原理印记到固相支持物上 (如尼龙膜),然后与变性的同位素标记探针特异性地在一定温度下退火,最后根据同位素标记情况分析杂交结果的分子生物学技术。
实验目的:Southern Blotting可用于多种实验目的,比如检测目的片段拷贝数,限制性片断长度多态性分析、外源基因的整合模式等等,该操作说明适用于水稻的目的片段拷贝数检测。
关键词: Southern blotting, RFLP, 拷贝数检测
材料与试剂
- 两个玻璃盘 (强烈建议用两个玻璃盘,而不要用搪瓷盘来洗胶,搪瓷盘较小且边沿不圆滑,操作时容易弄破凝胶)
- 一个搪瓷盘 (用来放一些杂物,如垫片等)
- 玻璃棒,玻璃板
- 铲胶板,吸水纸,尺子,铅笔,小刀,一个300 g的重物 (最好重量比较分散)
- 两张用作盐桥的滤纸 (如果是19.5 cm x 10 cm的标准尼龙膜,建议滤纸尺寸为35 cm x 14.5 cm) 以及两张覆盖膜的滤纸,比膜的长、宽各略大0.5 cm即可
- Klenow 酶(1 U/µl) (试剂盒)
- Tris (Sigma, catalog number: T-1378, FW 121.1)
- 硼酸
- EDTA
- NaAC·3H2O
- 冰醋酸
- Agarose (Biowest, Lot: 122000)
- Hind III (Takara)
- Agarose (Invitrogen, catalog number: 75510-019)
- λDNA Marker (λ-EcoR14 I digest) (Takara, catalog number: CK1801E)
- 浓HCl (中平能化集团开封东大化工有限公司试剂厂)
- 溴酚蓝
- NaCl (国药)
- NaOH (国药)
- Tris (Trizona base)
- Tris-sodian citrate (柠檬酸钠) (国药)
- SDS (Bio Basic Inc., LJ0303B7011J)
- Southern Blot Hybridization Buffer
- Random Primer DNA Labeling Kit Ver 2.0 (Takara, Lot BK3201)
- TE buffer
- 10х TAE buffer (见溶液配方)
- TBE buffer (见溶液配方)
- Depurination Solution (见溶液配方)
- Denaturation buffer (见溶液配方)
- Neutralization buffer(见溶液配方)
- Nucleic acid transfer buffer (20x SSC) (见溶液配方)
- Southern Blot Hybridization Buffer (见溶液配方)
- 洗膜液 (2x SSC + 0.1% SDS) (见溶液配方)
仪器设备
- NanoDrop 2000 (Thermo)
- 电泳槽
- 水浴锅和干浴锅
- 扫磷屏的机器为FUJIFILM的FLA-5100多功能影像分析仪,磷屏为该仪器配件
实验步骤
- 总DNA大样的检测
在总DNA大样抽提之后 (见水稻叶片高质量DNA抽提 [吴昊等,2018]),加入TE Buffer (pH 8.0),常温溶解至少7 d (最好半个月以上),每天上下颠倒几次,利于其快速溶解。溶解好之后,需进行质量检测。 - 大样酶切、转膜胶电泳
- 转膜前的准备 (可在转膜胶电泳期间完成)
- 转膜前对凝胶的处理
电泳结束之后,将凝胶连同制胶板取出,用蒸馏水轻柔地冲洗一下。取一块洗涤用的玻璃板,可在其下垫一张白纸 (起衬托背景的作用)。在玻璃板上洒一些蒸馏水,用手轻轻地将凝胶从制胶板上推到玻璃板上。凝胶强度不高,一定要小心操作避免凝胶破碎。 - 转膜
- 转膜后处理
- 预杂交 (试剂见溶液配方)
- 制备探针、加探针
使用Random Primer DNA Labeling Kit Ver 2.0 (Takara,Lot BK3201) 试剂盒标记探针。提前将同位素操作室里的水浴锅和干浴锅打开并分别调至37 °C和95 °C。根据同位素室使用手册的要求检测同位素室内相关区域的放射性信号,确定未污染后进行后续步骤。 - 洗膜
溶液配方
- 5х TBE
54 g Tris
27.5 g 硼酸
20 ml 0.5M EDTA, pH 8.0
加水至1 L,搅拌溶解
- 10х TAE
484.5 g Tris
80 ml 0.5M EDTA, pH 8.0
68 g NaAC·3H2O
用大约120 ml冰醋酸调pH至8.1加水至4,000 ml
- Depurination Solution (脱嘌呤溶液)
11 ml HCl (浓HCl)
989 ml灭菌蒸馏水
终浓度为0.125 M HCl (保质期1个月)
- Denaturation Buffer (变性液)
87.66 g NaCl (国药)
20 g NaOH (国药)
依次溶解,定容至1 L (保质期3个月)
- Neutalization Buffer (中和缓冲液)
87.66 g NaCl
60.5 g Tris (Trizona base)
先大概加700 ml灭菌水使溶解,用稍微浓一些的HCl调pH至7.5,定容至1 L (保质期3个月)
- Nucleic acid transfer buffer (转膜液20x SSC)
88.23 g Tris-sodian citrate (柠檬酸钠) (国药)
175.32 g NaCl
先加大约800 ml H2O使其溶解,此时pH应在7-8之间,定容至1 L (高盐溶液,可用搅拌子充分搅动,保质期3个月)
- Southern Blot Hybridization Buffer (Saghai’s Lab)
Final conc.
| Stock
| Vol.
|
5x SSC
| 20x
| 250 ml
|
50 mM PB (pH 6.8)
| 0.5 M
| 100 ml
|
5x Denhardt’s
| 50x
| 100 ml
|
2.5 mM EDTA (pH 8.0)
| 0.5 M
| 5 ml
|
100 μg/ml ssDNA
| 5 mg/ml
| 20 ml
|
0.4% SDS
| 20%
| 20 ml
|
Dextran sulfate
|
| 50 g
|
ddH2O to
|
| 1,000 ml
|
(以上成分依次添加,待前一成分充分溶解后再加入其它成分,SDS需最后添加)
- 洗膜液 (2x SSC + 0.1% SDS)
20x SSC
| 100 ml
|
20% SDS
| 5 ml
|
加水至
| 1,000 ml
|
参考文献
- 吴昊,陈太钰,林拥军,陈浩. (2018). 水稻叶片高质量DNA抽提. Bio-101 e1010102. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010102.
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.