实验原理:样品在Buffer A作用下细胞破裂,释放胞浆蛋白及其他蛋白,离心后所得沉淀中包含细胞核,再经高盐Buffer抽提可得到核蛋白。
实验目的:抽提核蛋白可用于PAGE电泳,Western blot,免疫共沉淀等下游实验,可排除胞质蛋白及其他蛋白的影响。
关键词: 核蛋白抽提, 高盐buffer, 低盐buffer, 透析
材料与试剂
注:所有试剂尽量用sigma进口试剂。
- 液氮
- 10 ml/50 ml离心管
- 1.5 ml离心管
- Miracloth (Calbiochem, catalog number: 475855)
- 各种型号枪头
- HEPES (pH 7.8)
- KCl
- MgCl2
- EDTA
- Sucrose
- Triton X-100
- DTT
- PMSF
- Glycerol
- Buffer A (见溶液配方)
- Low Salt Buffer (见溶液配方)
- High Salt Buffer (见溶液配方)
- Dialysis Buffer (透析液) (见溶液配方)
仪器设备
- 量筒
- 烧杯
- 天平
- 高速离心机
- 移液枪
- 振荡器
- 摇床
- 磁力转子
- 磁力搅拌器
- 计时器
- 透析袋
实验步骤
- 液氮磨样。
- 称5-10 g粉末,装入预冷10 ml/50 ml tube中,加入15-30 ml Buffer A,摇匀,致混合物呈可流动的粘稠液体。置冰上10 min,间或颠倒。
- 膜布(Miracloth)过滤,先单层膜布滤一次,再双层膜布滤一次。
- 将所得上清液4 °C离心,3,000 x g,20 min,可见绿色沉淀。
- 弃上清,用5 ml Buffer A重悬沉淀,轻柔吸打混匀,转至10 ml tube中。
- 4 °C离心,2,000 x g,15 min。
- 弃上清,用1 ml Buffer A重悬沉淀,轻柔吸打混匀,转至1.5 ml tube中。
- 4 °C离心,2,000 x g,10 min。
- 弃上清,加180 μl Low Salt Buffer,吸打混匀 (较难吸打)。
- 加270 μl High Salt Buffer,吸打混匀;若起始样品量较多,此步样品将变得极粘稠,吸打不动,只能用枪头搅匀。
- 将样品用冰袋包裹,放振荡器上振30 min;或置翻转摇床上4 °C摇1 h。
- 4 °C离心,14,000 x g,20 min。
- 吸上清,会吸到很多混浊物,再14,000 x g,4 °C离心5 min。
- 吸上清,移入1.5 ml tube中,-20 °C/-70 °C保存。如需进一步纯化见下步。
- (可选)透析:将上清吸入透析袋中,用夹子夹好,放入装有500 ml透析液的烧杯中,烧杯中加磁力转子,放在冰盒中,置磁力搅拌器上,透析袋漂浮于液面上,2 h;
- (可选)透析好的蛋白,从透析袋中吸出,移入1.5 ml tube中,-20 °C/-70 °C保存。
注意事项
- 所有操作均须在冰上进行,各种离心管、Buffer用前也需置冰中预冷。
- 根据样品量的多少,可相应适量增减几种Buffer用量。
溶液配方
注:所有试剂尽量用sigma进口试剂。
- Buffer A
10 mM HEPES(pH 7.8)
10 mM KCl
10 mM MgCl2
5 mM EDTA
250 mM sucrose
0.5% Triton-X-100
用前添加:1 mM DTT;0.2 mM PMSF
冰上预冷
- Low Salt Buffer
20 mM HEPES (pH 7.8)
20 mM KCl
1.5 mM MgCl2
0.2 mM EDTA
25% Glycerol
用前添加:0.5 mM DTT;0.2 mM PMSF
冰上预冷
- High Salt Buffer
20 mM HEPES (pH 7.8)
1.6 M KCl
1.5 mM MgCl2
0.2 mM EDTA
25% Glycerol
用前添加:0.5 mM DTT;0.2 mM PMSF
冰上预冷
- Dialysis Buffer(透析液)
20 mM HEPES(pH 7.8)
100 mM KCl
0.2 mM EDTA
20% Glycerol
用前添加:0.5 mM DTT;0.2 mM PMSF
冰上预冷
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