柑橘SSR分子标记操作方法
SSR Polymorphism Analysis in Citrus   

材料与试剂

1. 丙烯酰胺
   
2. N,N-甲叉双丙烯酰胺
   
3. 脲
   
4. Tris-Base
   
5. 硼酸
   
6. EDTA (乙二胺四乙酸二钠)
   
7. 过硫酸铵(APS)
   
8. TEMED (四甲基乙二胺)
   
9. 冰醋酸
   
10. 95%乙醇
    
11. 反硅化剂 (3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate) (4 °C保存)
    
12. 硅化剂 (Acryl-Glide)
    
13. 硝酸银
    
14. 无水碳酸钠
    
15. 氢氧化钠
    
16. 甲醛溶液
    
17. 二甲苯青
    
18. 溴酚蓝
    
19. 甲酰胺
    
20. 用于检测的PCR产物
    
21. 5x TBE (见溶液配方)
    
22. 丙烯酰胺母液(见溶液配方)
    
23. 10% APS (见溶液配方)
    
24. 反硅化液 (见溶液配方)
    
25. 银染液 (见溶液配方)
    
26. 显色液 (见溶液配方)
    
27. 上样缓冲液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 电泳仪
   
2. 制胶用的长、短玻璃板，塑料边条
   
3. 电泳梳子
   
4. 涡旋仪
   
5. 移液器
   
6. 燕尾夹
   
7. PCR仪
   

实验步骤

1. 用自来水将长、短玻璃板分别洗干净，晾干水分后，用纸巾沾取95%乙醇擦洗两遍，在长玻璃板上均匀涂抹约1.5 ml的反硅化液，在短玻璃板上均匀涂抹4-5滴的硅化剂，晾干后使用。
   注：清洗长、短玻璃板使用不同的清洁棉，以免影响硅化液与反硅化剂的效果；涂抹短玻璃板时因反硅化剂量较少，可先用95%乙醇湿润纸巾后涂抹。
   
2. 将塑料边条洗净后放置于长玻璃板两侧边缘，然后将短玻璃板小心扣于长玻璃板上，对齐后使用3对燕尾夹将玻璃板固定，对称地夹在放有塑料边条处。
   
3. 取50 ml丙烯酰胺凝胶母液，加入250 μl 10%的APS和25 μl TEMED，混匀后配成工作液。
   
4. 将工作液倒入长、短玻璃板中间的隔缝里，然后将梳子平滑的一面插入短玻璃板的凹槽处，聚合1-1.5 h后即可进行电泳。
   注：此步骤操作时容易产生气泡，应均匀倒工作液，如果产生气泡须及时除去。
   
5. 小心取出梳子，将梳子清洗干净备用，同时将玻璃板外部及短玻璃板凹槽处的碎胶清洗干净，也可用滤纸进行清除。
   
6. 上、下电泳槽分别加入约500 ml和400 ml的0.5倍TBE电泳液，以80 W的功率预电泳20-30 min，用1 ml移液器将点样槽中的杂质冲洗掉，插上梳子。
   
7. 预电泳时可将PCR产物进行变性处理，即在产物中加入上样缓冲液 (一般10 μl产物中加入5 μl的上样缓冲液)，95°C变性5 min后冰浴3-5 min，上样量为3.0-3.5 μl，以80 W的功率电泳约1 h，即二甲苯青示踪条带距底部1/4处即可停止电泳。
   注：变性后的产物不能存放太久，上样前再进行变性。
   
8. 分离两块玻璃板，用双蒸水漂洗长玻璃板1次，取出后稍沥水，置于银染液中10-12 min。
   
9. 从银染液中取出玻璃板，在双蒸水中迅速漂洗一遍 (不超过10 s)，取出后置于显色液中，直至条带清晰，取出后用双蒸水漂洗1-2 min。
   
10. 晾干玻璃板，拍照保存后读取条带进行相应分析 (如图1)。
    
    
    图1. 柑橘中SSR的PAGE结果示例
    

溶液配方

1. 5x TBE

   Tris-Base	108 g
   硼酸	55 g
   0.5 M-EDTA(pH 8.0-8.5)	40 ml
   ddH2O	to 2 L

2. 丙烯酰胺母液(过滤后于4°C保存)

   丙烯酰胺	114 g
   N,N-甲叉双丙烯酰胺	6 g
   脲	840 g
   5x TBE	200 ml
   ddH2O	to 2 L

3. 10% APS(4°C保存，可使用一周)

   过硫酸铵	1 g
   ddH2O	to 10 ml

4. 反硅化液

   0.5%冰醋酸+95%乙醇	1.5 ml
   反硅化剂(3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate)	3.5 μl

5. 银染液

   硝酸银	3 g
   ddH2O	2 L

6. 显色液(使用不超过6次)

   无水碳酸钠	1 g
   氢氧化钠	33.3 g
   甲醛溶液	10 ml
   ddH2O	to 2 L

7. 上样缓冲液

   二甲苯青	0.1 g
   溴酚蓝	0.1 g
   0.5 M-EDTA (pH 8.0-8.5)	1 ml
   甲酰胺	100 ml