实验原理:聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛效应,且分辨率极高。聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)可以区分所扩增SSR片段间的差异,通过银染显色可以确认核酸中特异SSR的多态性。
实验目的:分析柑橘中SSR位点的多态性。
关键词: 柑橘, SSR分子标记, PAGE, 银染
材料与试剂
- 丙烯酰胺
- N,N-甲叉双丙烯酰胺
- 脲
- Tris-Base
- 硼酸
- EDTA (乙二胺四乙酸二钠)
- 过硫酸铵(APS)
- TEMED (四甲基乙二胺)
- 冰醋酸
- 95%乙醇
- 反硅化剂 (3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate) (4 °C保存)
- 硅化剂 (Acryl-Glide)
- 硝酸银
- 无水碳酸钠
- 氢氧化钠
- 甲醛溶液
- 二甲苯青
- 溴酚蓝
- 甲酰胺
- 用于检测的PCR产物
- 5x TBE (见溶液配方)
- 丙烯酰胺母液(见溶液配方)
- 10% APS (见溶液配方)
- 反硅化液 (见溶液配方)
- 银染液 (见溶液配方)
- 显色液 (见溶液配方)
- 上样缓冲液 (见溶液配方)
仪器设备
- 电泳仪
- 制胶用的长、短玻璃板,塑料边条
- 电泳梳子
- 涡旋仪
- 移液器
- 燕尾夹
- PCR仪
实验步骤
- 用自来水将长、短玻璃板分别洗干净,晾干水分后,用纸巾沾取95%乙醇擦洗两遍,在长玻璃板上均匀涂抹约1.5 ml的反硅化液,在短玻璃板上均匀涂抹4-5滴的硅化剂,晾干后使用。
注:清洗长、短玻璃板使用不同的清洁棉,以免影响硅化液与反硅化剂的效果;涂抹短玻璃板时因反硅化剂量较少,可先用95%乙醇湿润纸巾后涂抹。
- 将塑料边条洗净后放置于长玻璃板两侧边缘,然后将短玻璃板小心扣于长玻璃板上,对齐后使用3对燕尾夹将玻璃板固定,对称地夹在放有塑料边条处。
- 取50 ml丙烯酰胺凝胶母液,加入250 μl 10%的APS和25 μl TEMED,混匀后配成工作液。
- 将工作液倒入长、短玻璃板中间的隔缝里,然后将梳子平滑的一面插入短玻璃板的凹槽处,聚合1-1.5 h后即可进行电泳。
注:此步骤操作时容易产生气泡,应均匀倒工作液,如果产生气泡须及时除去。
- 小心取出梳子,将梳子清洗干净备用,同时将玻璃板外部及短玻璃板凹槽处的碎胶清洗干净,也可用滤纸进行清除。
- 上、下电泳槽分别加入约500 ml和400 ml的0.5倍TBE电泳液,以80 W的功率预电泳20-30 min,用1 ml移液器将点样槽中的杂质冲洗掉,插上梳子。
- 预电泳时可将PCR产物进行变性处理,即在产物中加入上样缓冲液 (一般10 μl产物中加入5 μl的上样缓冲液),95°C变性5 min后冰浴3-5 min,上样量为3.0-3.5 μl,以80 W的功率电泳约1 h,即二甲苯青示踪条带距底部1/4处即可停止电泳。
注:变性后的产物不能存放太久,上样前再进行变性。
- 分离两块玻璃板,用双蒸水漂洗长玻璃板1次,取出后稍沥水,置于银染液中10-12 min。
- 从银染液中取出玻璃板,在双蒸水中迅速漂洗一遍 (不超过10 s),取出后置于显色液中,直至条带清晰,取出后用双蒸水漂洗1-2 min。
- 晾干玻璃板,拍照保存后读取条带进行相应分析 (如图1)。
图1. 柑橘中SSR的PAGE结果示例
溶液配方
- 5x TBE
Tris-Base
| 108 g
|
硼酸
| 55 g
|
0.5 M-EDTA(pH 8.0-8.5)
| 40 ml
|
ddH2O
| to 2 L
|
- 丙烯酰胺母液(过滤后于4°C保存)
丙烯酰胺
| 114 g
|
N,N-甲叉双丙烯酰胺
| 6 g
|
脲
| 840 g
|
5x TBE
| 200 ml
|
ddH2O
| to 2 L
|
- 10% APS(4°C保存,可使用一周)
- 反硅化液
0.5%冰醋酸+95%乙醇
| 1.5 ml
|
反硅化剂(3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate)
| 3.5 μl
|
- 银染液
- 显色液(使用不超过6次)
无水碳酸钠
| 1 g
|
氢氧化钠
| 33.3 g
|
甲醛溶液
| 10 ml
|
ddH2O
| to 2 L
|
- 上样缓冲液
二甲苯青
| 0.1 g
|
溴酚蓝
| 0.1 g
|
0.5 M-EDTA (pH 8.0-8.5)
| 1 ml
|
甲酰胺
| 100 ml
|
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.