摘要:本实验流程叙述如何由雌性果蝇腹腔取出完整的卵巢,并进一步解剖出其卵管(ovarioles),再经由体外培养 (ex vivo) 的方式使卵室 (egg chambers) 维持基本功能,并透过光学显微镜进行即时影像分析。此流程着重于分析第九至十期的卵室发育,此阶段的卵室,前端的卵泡细胞 (follicle cells) 会有4~8颗细胞组成一群组 (cluster),且开始往卵母细胞 (oocyte) 的边境 (border) 方向迁移,因此我们亦称这群会移动的细胞为边境细胞 (border cells)。此流程能维持卵室在体外培养时间长达8小时,以即时观察边境细胞迁移的状态。亦可观察不同基因型卵室的即时发育过程,并通过生物感应器 (biosensors) 同步观察讯号传递分子的变化,此流程建立亦有助于测试药物对正常或癌化细胞迁移的影响。
关键词: 即时影像, 边境细胞, 体外培养, 卵巢发育
材料与试剂
- µ-Dish 35 mm, low (ibidi GmbH, catalog number: 80136)
- ADVANTEC NO.20 pH试纸 (Advantec®, catalog number: 07010110)
- 凹陷载玻片
- 培养管
- 干酵母菌颗粒
- 处女果蝇 (雌果蝇)
- 雄果蝇
- 无菌双蒸水 (ddH2O)
- Insulin (Beef), United States Pharmacopeia (USP) (Sigma-Aldrich, catalog number: 1342208)
- Schneider's Drosophila Medium (S2培养液) (Thermo Fisher Scientific, Gibco, catalog number: 80136)
- Fetal Bovine Serum (Thermo Fisher Scientific, Gibco, catalog number: 10082147)
- 体外培养液 (见溶液配方)
- 果蝇萃取液 (见溶液配方)
仪器设备
- Dumostar精密手术镊子 (Dumont, catalog number: 0209-5-PO)
- 离心机 (Eppendorf, model: Centrifuge 5424)
- Leica EZ4体视显微镜 (Leica, model: EZ4)
- Zeiss Observer D1 microscopy (Zeiss, model: Observer D1)
软件
- AxioVision SE64Rel.4.8.2 software
实验步骤
一、准备雌果蝇以解剖卵巢样本
- 将欲做分析的处女果蝇 (female virgin) 与数只雄果蝇放置于新鲜的食物培养管中,并加入2~4颗干酵母菌颗粒,然后将含有果蝇的管子放在18 °C两天,并注意每天更换新食物培养管,待其卵巢成熟。
- 两天后将果蝇换到新的食物管中,并重复步骤1,加入2~4颗的干酵母菌颗粒,再将此管放在25 °C,12至14个小时。
注:
二、解剖雌果蝇卵巢以游离其卵管 (ovariole) 或卵室
- 利用二氧化碳气体 (CO2) 麻醉2到3只欲做分析的雌果蝇。
- 在凹陷载玻片中加入150 μl体外培养液 (见溶液配方),并置于解剖显微镜下。
- 利用一只镊子轻轻的将一只雌果蝇夹起移动到体外培养液中,并将果蝇翻转使背部贴在载玻片上。用另一只镊子夹住腹部表皮层 (图1A和视频1) 向外剥,拉扯出一对白色不透明卵巢 (图1B和视频1) (Prasad等,2007)。重复步骤3将每只雌果蝇的卵巢剥出收集至体外培养液中。
视频1. 从母果蝇的腹部取出卵巢
- 在体外培养液中,用一只镊子夹住卵巢的根部 [靠近发育晚期的卵室所在位置 (图1C左半部和视频2)],另外一只镊子夹住卵巢前缘尖端 [此处包含干细胞和早期的卵室 (图1C右半部和视频2)],并且将卵管向外拉出 (图1D和视频2),重复此步骤直到将所有的卵管皆游离出来。
- 小心地移除晚期卵室 (大于发育阶段10),若有些晚期的卵室仍附着于欲观察阶段8~9的卵室上(图1D和视频2),在此步骤要极小心,用一支镊子夹住最大的卵室一端,向外拉,拉断发育阶段10之前的卵室与较老卵室之间的连接,尽量避免碰触所要观察的卵室。
注:过多成熟的卵室会消耗体外培养液的养分,所以卵室无法长时间在体外培养液生长。因此在解剖卵室时需要将发育阶段10或是更老的卵室移除,才不会影响待观察卵室的生长。同时此培养液的养分通常仅足够培养1~2只雌果蝇解剖后的卵室,一次解剖太多只果蝇反而造成相反的效果。
图1. 解剖雌果蝇卵巢以游离其卵管或卵室
视频2. 游离雌果蝇的卵室
三、置放卵室于培养皿
- 准备ibidi µ-Dish,用于放置样本,如图2所示,并且利用无菌的二次水沾湿棉花围绕于培养皿周围 (图2 Top view) (Chang等,2018),防止体外培养液在影像拍摄过程中水分的散失。
- 吸取解剖后卵室包含体外培养液约100 μl放置于上述培养皿中,并再加入50 μl体外培养液到培养皿中 (图2)。
图2. 培养皿中卵室放置的示意图
四、显微即时影像撷取设定
- 将培养皿放在显微镜下,先以低倍率物镜找到欲观察的卵室 (图3A-3B),移到视野下。避免选择形状异常,外围卵泡细胞排列不规则或有明显破损的样本 (图3C-3D)。
图3. 显微镜下正常卵室 (A-B) 以及性状异常 (C-D) 的样例
- 以20倍物镜观察拍摄,调整焦距后,透过AxioVision SE64Rel.4.8.2 software侦测适当的曝光程度及时间,控制每间隔3分钟撷取一次影像 (如图4,步骤1~4)。
图4. 显微即时影像撷取软件设定步骤1~4
- 在即时影像撷取期间,每隔30分钟请注意细胞是否失焦,可于AxioVision SE64Rel.4.8.2 software中按暂停 (pause),重新对焦 (refocus),再继续拍摄 (如图5,步骤5~9)。
注:
有助于卵室附着的物质,在重复使用及清洗下将毁损,造成细胞无法附着,拍摄时卵室会有位移的现象。所以建议重复使用以一次为限。
图5. 显微即时影像撷取软件设定步骤5~9. 步骤9 (a)欲重新调整曝光时间以及重新对焦请按“Pause”做调整 (b)调整完后按“Continue”继续拍摄。
视频3. 卵室细胞即时摄影
溶液配方
- 体外培养液 (总体积1 ml)
48% Schneider's Drosophila Medium (S2培养液)
50% Fetal Bovine Serum
200 μg/ml Insulin (溶于0.1 N HCl)
20 μl雌果蝇萃取液 (见下列详述制备程序)
体外培养液需新鲜配制,配完后,以试纸测量pH值,必须在6.8~7.0之间 - 雌果蝇萃取液
先将10只雌果蝇利用酵母菌糊喂食培养于29 °C 14小时后,将10只雌果蝇以CO2迷昏,置入1.5 ml Eppendorf管中,并加入100 μl S2培养液,磨碎。之后在4 °C以20,000 × g离心2分钟,并吸取上清液至新的 Eppendorf管即完成
致谢
- 科技部计划:MOST 107-2311-B-006-002-MY3;
- 教育部顶大计划:The Headquarters of University Advancement at the National Cheng Kung University granted by the Ministry of Education,Taiwan.
参考文献
- Chang, Y. C., Wu, J. W., Hsieh, Y. C., Huang, T. H., Liao, Z. M., Huang, Y. S., Mondo, J. A., Montell, D. and Jang, A. C. (2018). Rap1 negatively regulates the hippo pathway to polarize directional protrusions in collective cell migration. Cell Rep 22(8): 2160-2175.
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M. and Montell, D. J. (2007). A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nat Protoc 2(10): 2467-2473.
Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:王珏文, 吴榛惟, 张玉泉, 张纯纯. (2019). 果蝇卵巢细胞培养即时影像分析系统.
Bio-101: e1010297. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010297.
How to cite: Wang,
C. W., Wu, J. W., Chang, Y. C. and Jang, A. C. (2019). Live Imaging of Collective Cell Migration in the
Drosophila Ovary.
Bio-101: e1010297. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010297.